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双分离法记录Wistar大鼠神经元的全细胞电流
背景:细胞培养与通道电流记录是全细胞膜片钳实验的主要难点.目的:介绍一种简单可行的降低全细胞膜片钳实验方法,将细胞急性分离与电流的分离技术结合起来,以提高工作效率,缩短实验的时间,从根本上降低膜片钳实验的难度.方法:SPF级出生4～7 d的wistar大鼠40只,雌雄不限.采用改良的急性分离的方法制备Wistar大鼠脑皮质细胞,将大鼠脑皮质切成400～600μm厚度的薄片,在人工脑脊液中通混合气静止1 h,并通以氧气.将脑组织块放入含有16 u/mL(typeX)和2 u/mL(type XIV)蛋白水解酶的人工脑脊液中,孵育60 min,清除消化酶.在全细胞电压钳制模式下,保持电位～80 mV,给予-60 mV到60 mV的去极化脉冲刺激,步阶为+10 mV,刺激波宽160 ms.记录到跨膜总电流,在全细胞电极液里面加入70 mmol/LCsCl,70 mmol/L CsF;在外液中先后加入11 μmol/L阻断剂河豚毒素、30 mmol/L的氯化四乙胺、1 mmol/L的4-AP.分别记录内向钠电流,瞬时外向钾电流和延迟整流钾电流,结果用clampfit分析处理.主要观察:①细胞的形态学观察.②全细胞电流的记录.③内向钠电流的记录.④外向钾电流的记录.结果与结论:细胞空间立体结构强,表面光滑,有完整的树突或者轴突,且细胞的活性可以在25℃室温下维持8-10 h.在外液中加入1 μmol/L的河豚毒素基本上可以阻断钠电流;30 mmol/L的氯化四乙胺和1 mmol/L的4-AP可以阻断外向钾电流.结果表明,改良的细胞急性分离方法细胞功能完好.通过电流分离技术,不改变细胞外液和电极液,仅需添加特异阻断剂,可记录到内向钠电流,瞬时外向钾电流以及延迟整流钾电流,较之传统方法可显著提高工作效率.
