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角质形成细胞的培养及其表皮生长因子受体表达
目的:在成功分离人皮肤角质形成细胞的基础上,观察表皮生长因子受体在人皮肤角质形成细胞中的表达情况.方法:实验于2006-3/10在北京大学深圳医院中心实验室进行.采用dispaseⅡ-trypsin两步消化法获取表皮基底层细胞,用小鼠皮肤成纤维母细胞滋养层和黄素腺嘌呤二核苷酸培养液进行培养.小鼠皮肤成纤维母细胞的预处理:向对数生长期的小鼠皮肤成纤维母细胞培养液中加入丝裂霉素C至终浓度为4 mg/L,37 ℃下培养4 h,弃去培养液,用D-Hank's液洗3次,加入浓度为0.25 g/L的胰蛋白酶消化,分离出细胞,离心(200 g,5 min),用黄素腺嘌呤二核苷酸培养液悬浮细胞,计数,以5.0×104 /cm2的密度种于培养皿内,37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱下培养.角质形成细胞的培养:将分离的角质形成细胞悬浮在黄素腺嘌呤二核苷酸培养液中,以2.0×104 /cm2的密度接种在前1天经丝裂霉素C处理的小鼠皮肤成纤维母细胞滋养层上,37℃、体积分数0.05的CO2培养箱下培养.24 h换液,以后每3 d换1次液.采用免疫细胞化学的方法检测表皮生长因子受体的表达,采用复合逆转录聚合酶链反应检测角质形成细胞中表皮生长因子受体mRNA的表达.结果:采用dispase Ⅱ消化法分离了真皮和表皮,获得较多的角质形成细胞,可以避免真皮成纤维细胞的污染.人皮肤角质形成细胞在黄素腺嘌呤二核苷酸培养液中培养5 d可见明显的集落,约10 d可长满单层.免疫细胞化学显示表皮生长因子受体在细胞表面有明显的表达,复合逆转录聚合酶链反应显示表皮生长因子受体mRNA有明显的表达.结论:用小鼠皮肤成纤维母细胞滋养层和黄素腺嘌呤二核苷酸培养液可以较好地培养原代人皮肤角质形成细胞,表皮生长因子受体在细胞表面有明显的表达,这些结果为与表皮生长因子受体相关的皮肤病(如银屑病)的研究奠定了基础.
关键词： 细胞培养技术 受体"表皮生长因子/代谢 皮肤/细胞学
