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抗病毒1号中药有效部位抗流感病毒FM1的实验研究
本研究采用细胞培养技术对抗病毒1号中药有效部位(AD1)抗流感病毒FM1活性进行了研究,现将实验结果报告如下.
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右归饮对激素性股骨头坏死大鼠体外诱导培养成骨细胞作用的研究
目的:在右归饮对体外正常大鼠成骨细胞的增殖和分化作用研究基础上,进一步观察右归饮对激素性股骨头坏死大鼠体外诱导培育成骨细胞的增殖和分化以及基因表达的影响.方法:取体重为100～120g雄性SD大鼠20只,臀肌注射醋酸强的松龙49 mg/kg·d,连用6 d(造模),7 d后处死,无菌条件下取造模大鼠骨髓基质细胞,诱导培养成骨细胞,然后随机分为4组:高、中、低浓度右归饮含药血清组(R1、R2、R3)和对照组(R4),分别添加高、中、低浓度右归饮含药血清及对照血清,继续培养72 h后,进行成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性、骨保护素(OPG)和破骨细胞分化因子(RANKL)表达水平检测(实时荧光定量PCR检测),并进行统计学分析.结果:高、中浓度右归饮含药血清组(R1、R2)与对照组(R4)相比,成骨细胞增殖率显著升高(P＜0.01),碱性磷酸酶活性显著升高(P＜0.01),成骨细胞OPGmRNA的相对表达量显著升高(P＜0.01),且与浓度剂量呈一定的正相关;成骨细胞RANKL mRnNA显著降低(P＜0.01).低浓度右归饮含药血清组(R3)与对照组(R4)相比,成骨细胞增殖率、碱性磷酸酶活性以及OPG、RANKL mRNA相对表达量无统计学差异.结论:高、中浓度的右归饮含药血清对体外培养的SINFH大鼠成骨细胞的增殖和分化具有明显的促进作用,并可提高成骨细胞OPG mRNA的相对表达量而对其RANKL mRNA有抑制作用.右归饮含药血清对体外诱导培养成骨细胞的作用与剂量有一定相关性,在一定的浓度范围内促进成骨细胞的分化、增殖.
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体外肾系膜细胞对成骨细胞增殖及功能的影响
目的:从生长因子角度研究肾小球系膜细胞对成骨细胞增殖及功能的影响和机制.方法:应用体外细胞培养的方法,将成骨细胞分为正常血清组和系膜细胞组,分别予10％正常血清培养液及20％系膜细胞培养上清液.MTT法分别检测培养24、48、72、120 h后两组成骨细胞增殖情况；在培养72及144h后检测上清液骨钙素(BGP)及骨桥蛋白(OPN)浓度；在培养144h后检测培养液胰岛素样生长因子-α(IGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)的浓度.结果:在培养的各个时间点,系膜细胞组的成骨细胞增殖均明显高于正常血清组(P＜0.05).在培养72、144h后,系膜细胞组BGP及OPN的浓度分别高于正常血清组11.3％、16.4％和55.0％、39.6％.在培养144h后,系膜细胞组的IGF-α、TGF-β浓度比正常血清组分别增高10.1％和47.7％.结论:肾小球系膜细胞能直接作用于成骨细胞,促进成骨细胞的增殖及功能.这种作用可能是通过促进成骨细胞分泌TGF-β来实现的.
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人股骨头骨微血管内皮细胞的分离培养方法
目的:探讨培养人股骨头骨微血管内皮细胞分离培养方法.方法:2013年10月至2014年1月15例行髋关节置换患者切除的内部无病变的股骨头,男2例,女13例;年龄38～92岁,平均71.2岁.无菌条件下将股骨头内松质骨咬成碎骨粒,放入培养基.采用酶消化法,密度梯度离心法分离细胞;差速贴壁法,选择性培养基法纯化细胞.倒置显微镜观察细胞特点,并采用vWF、CD31免疫荧光进行细胞鉴定.结果:原代培养24 h后倒置显微镜下观察细胞数量与患者年龄呈正相关,年龄越大细胞越少.培养4～5 d细胞呈短梭形、多角形或“鹩卵石”状.培养7～10d细胞生长密集,细胞融合呈漩涡状,接触抑制明显.vWF、CD31免疫荧光检测阳性率100％,表明细胞为骨微血管内皮细胞.结论:人股骨头骨微血管内皮细胞分离培养方法简单、稳定、有效、可重复性好,可以获得纯度较高的股骨头骨微血管内皮细胞.
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循环静水压力对维持兔软骨细胞表型的影响
目的:本研究将兔软骨细胞放在静水压力负载装置中培养,并传代,施加不同频率和大小的静水压,观察其对兔软骨细胞表型的影响.方法:用酶消化法获取兔关节软骨细胞,分别在不同的压力和频率下作普通培养瓶贴壁的单层培养,并传代.40 kPa循环静水加压为实验组,40 kPa持续静水加压培养和常压培养作为对照.Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原免疫组化,苏木素套核染色,倒置显微镜观察摄像.以RT-PCR方法检测软骨细胞中蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原mRNA的表达.结果:在循环静水压力下培养,软骨细胞有较高的细胞增殖率,培养至第7代未见明显表型改变,仍然表达Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖等.常压培养,软骨细胞传代至第5代以后,逐渐失去软骨细胞的特有表型.而持续静水压力培养的软骨细胞传代至第3代以后就开始逐渐失去软骨细胞的特有表型.结论:一定的循环静水压力能维持软骨细胞的合成分泌功能,有助于软骨细胞特有表型的稳定.
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体外负压培养对骨髓间充质干细胞成骨活性的影响
目的:探讨体外负压培养对骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived stroma cells,BMSCs)成骨活性的影响.方法:取第3代BMSCs分为实验组和对照组,实验组进行间歇性负压培养,设置压力为17 kPa,每次30 min,每日4次,干预2周；对照组于普通CO2培养箱中常规培养.倒置显微镜下观察细胞形态,检测ALP活性,免疫组织化学检测Ⅰ型胶原的表达,RT-PCR检测2周后以及终止负压后l、2、3d骨保护素(osteoprotegerin,OPG) mRNA和骨保护素配体(osteoprotegerin ligand,OPGL) mRNA表达水平.结果:诱导2周后,BMSCs呈现出显著的成骨细胞特性,与对照组比较,ALP活性显著增加,Ⅰ型胶原表达阳性,实验组细胞OPG mRNA表达水平显著提高,OPGL mRNA表达水平显著降低,且差异均有统计学意义(P＜0.05).负压终止后3d,两组细胞OPG mRNA和OPGLmRNA表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论:体外负压培养可以提高BMSCs成骨活性.
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细胞培养操作中常见问题及处理对策
细胞培养技术广泛用于科研、教学及临床研究实验,这项技术看似简单又不太容易操作.首先从概念上说,细胞是生命的小单位,离体以后失去了生命体给予的一切复杂的机体内环境,在实验室内能够生长并形成一定生长规律,是研究者们经过长期研究摸索总结得到的科研成果.
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培养瘤细胞及瘤株不同冻存方法与细胞存活之间的影响因素初步探讨
在生物学和医学研究中,细胞培养技术是重要的手段之一,肿瘤研究中移植性肿瘤又称瘤株传代也是基本的常用技术.关于瘤细胞培养后和瘤株建成后如何将细胞系和瘤株保存好是很值得研究的内容.
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《组织和细胞培养技术》（第3版）出版
《组织和细胞培养技术》（第3版）近已由人民卫生出版社出版。作为研究生培养的一门技术性课程。本版一如既往，在“基本理论”和“基本知识”的基础上，更加注重“基本技能”的训练。在“思想性”、“科学性”、“先进性”和“启发性”的基础上更加注重“适用性”。这一编写原则或许也可以称之为“Graduated Based Learning”（ GBL）。
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肝窦内皮细胞的分离培养及体外生长规律的观察
目的：建立大鼠肝窦内皮细胞（SEC）的分离培养的方法，观察SEC体外培养的生长特点。方法通过门静脉插管进行胶原酶原位灌注，结合离体消化、Percoll密度梯度离心法分离SEC；应用Ⅷ因子和CD14间接免疫荧光法观察SEC表面分子的表达进行细胞鉴定；应用光学显微镜、电子显微镜、并首次使用原子力显微镜（AFM）观察体外培养状态下SEC的超微结构及形态学变化。结果 SEC获得率为每只大鼠（2.95±0.31）×107，细胞活力好。免疫荧光法鉴定CD14阳性率约达99%，Ⅷ因子相关抗原抗体阳性率约为2%。光学显微镜下观察，细胞形态变化典型，并持续增殖。电子显微镜下观察到细胞典型的由成簇窗孔组成的筛板样结构；AFM下实现了对SEC的三维结构的观察，细胞骨架清晰。结论高纯度、活力好的SEC的成功培养及体外生长规律的观察，为研究SEC在肝脏生理病理过程中作用提供了前提条件。
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干式融化箱与水浴锅复苏细胞因子诱导的杀伤细胞的比较
目的 对比干式融化箱与水浴锅复苏冻存细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)的效果.方法 提取10份健康志愿者外周血单个核细胞分别诱导培养CIK细胞并冻存于-80℃冰箱.1个月后从每份CIK细胞中取出相同的两个冻存管,分别采用干式融化箱和水浴锅进行复苏.记录复苏时间,检测复苏后细胞存活率及对K562细胞的杀伤作用.结果 干式融化箱较水浴锅复苏时间较长[(4.33±0.19)min、(2.47±0.30) min],差异有统计学意义(P＜0.05).但两种方法复苏的CIK细胞存活率[(89.55±5.36)％、(89.86±4.63)％]和对K562细胞的杀伤活性[(44.76±9.53)％、(46.97±10.17)％]差异无统计学意义(P＞0.05).结论 干式融化箱可以代替水浴锅进行冻存CIK细胞复苏.
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小鼠血管外膜成纤维细胞原代培养及生物学特性
目的 建立小鼠胸主动脉外膜成纤维细胞(adventitial fibroblasts,AF)组织块贴壁法培养模型.方法 组织块贴壁法培养小鼠AF,并在光镜下观察细胞形态,免疫细胞荧光染色法鉴定细胞类型,绘制细胞生长曲线.结果 AF能够迅速从组织块长出并增殖,光镜下细胞呈梭形或多边形,免疫荧光染色结果显示细胞质中有波形蛋白相关抗原存在,CD31和α-平滑肌肌动蛋白染色为阴性,细胞在第2～7天进入指数生长期.结论 组织块贴壁法适用于小鼠AF的原代培养,为研究AF生物学功能提供了充足、可靠的靶细胞模型.
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兔颈静脉内皮细胞的原位消化、体外获取及培养
目的 建立兔颈静脉内皮细胞原位消化、体外获取及培养的方法.方法 仅解剖游离单侧兔颈静脉,并保留在原位,对侧颈静脉不进行解剖游离.阻断该静脉段的两端并插管,向该静脉段内灌注Ⅰ型胶原酶进行原位消化.切取该颈静脉段,离体状态下获取兔颈静脉内皮细胞,使用EGM-2培养基培养并传代.倒置显微镜、透射电镜观察获取的兔颈静脉内皮细胞,免疫组化法检测Ⅷ因子.结果 获取的兔颈静脉内皮细胞原代培养7～10d左右可达到80％融合.光镜下细胞为短梭形或多角形,呈“鹅卵石”样排列.透射电镜可见内皮细胞特征性的Weibel-Palade小体.兔Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测阳性.获取的兔颈静脉内皮细胞进行冻存、复苏和传代后均可以正常生长.结论 成功建立了兔颈静脉内皮细胞原位消化、体外获取及培养的方法.
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三种方法培养大鼠结肠平滑肌细胞的比较
目的 比较3种不同方法培养大鼠结肠平滑肌细胞(CSMC)的生长情况.方法 分离大鼠末端结肠,剥离浆膜层和黏膜层获得平滑肌组织层,将平滑肌组织层剪成小块,采用3种不同方法原代培养大鼠CSMC:(1)贴壁法:将组织块直接接种于培养瓶中.(2)酶解法①:使用0.1％Ⅱ型胶原酶和0.01％大豆胰蛋白酶抑制剂消化组织块2次,然后接种于培养瓶中.(3)酶解法②:使用0.25％胰蛋白酶消化组织块,然后用0.1％Ⅱ型胶原酶和0.01％大豆胰蛋白酶抑制剂消化2次,接种于培养瓶中.按上述3种方法进行大鼠CSMC的原代培养,待细胞长成致密单层后进行传代,观察细胞生长情况并进行免疫荧光检测鉴定细胞类型.结果 贴壁法培养6d可以见细胞从组织块周围游出,但由于细胞数少无法进行传代;酶解法①培养36 h可见少量细胞贴壁,培养15～20 d可以进行传代;酶解法②培养36 h可见较多细胞贴壁生长,培养l0d可以进行传代.酶解法①和酶解法②培养的细胞传代后,细胞形态和生长速度无明显区别.免疫荧光检测显示,3种方法培养的细胞均为α-平滑肌肌动蛋白阳性,90％以上为CSMC.结论 3种培养方法均可得到急性分离的大鼠CSMC,在细胞质量方面无明显差别,实验中可根据具体情况选用不同的培养方法.
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两种酶消化法培养小鼠气道平滑肌细胞的比较
目的 比较两种酶消化法原代培养小鼠气道平滑肌细胞(ASMC)的生长情况.方法取SPF级雄性昆明小鼠10只,处死后分离气管组织,分别采用Ⅰ型胶原酶消化法(单酶消化法)和链霉蛋白酶+Ⅰ型胶原酶消化法(双酶消化法)原代培养ASMC.倒置显微镜下观察细胞形态,免疫荧光鉴定细胞类型.结果单酶消化法培养2~3 d可见少量细胞贴壁伸展,15 d左右可进行传代.双酶消化法培养2~3d可见较多细胞贴壁伸展,7~9d可进行传代.免疫荧光检测显示,胞质中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)呈红色阳性反应,两种方法所培养的细胞95%以上为ASMC.结论两种方法均可获得高纯度的ASMC,在细胞质量方面无明显差异.单酶消化法操作简便,但细胞培养周期较长,双酶消化法细胞生长较快但操作相对复杂.
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麻疹病毒的分子流行病学
麻疹是我国计划免疫的6种传染病之一。世界卫生组织（WHO）估计，全 球每年仍有麻疹病例约4*!000万，其中100万儿童死于麻疹，在疫苗可预 防的病毒性疾病当中麻疹仍是死亡例数多的。麻疹是我国法定的乙类传染病 ，我国从1965年开始使用麻疹减毒活疫苗，特别是1978年开展计划 免疫工作之后，我国麻疹发病率得到有效的控制，但在1987～1999 年，我国麻疹的报告发病率每年仍在5／10万～10／10万。“九五”期间 ，麻疹在我国法定的35种传染病发病数中排在前6位，估计麻疹实际发病率 高于报告发病率，麻疹仍然是严重危害我国儿童身体健康的主要传染病之一。 WHO要求在已经建立无脊髓灰质炎地区的国家将消除麻疹做为下一个目 标。卫生部在1997年已经发布了《加速麻疹控制规划指南》。加强 我国麻疹病毒分子流行病学的研究，是控制、消除、消灭麻疹的基础工作。 麻疹病毒属于副粘病毒科麻疹病毒属。麻疹病毒属包括犬疫病毒（Can ine distemper viruses），牛疫病毒（Rinder pest virus）、羊疫病毒（Peste des petit r uminants）、鲸疫病毒（Cetacean virus）和海狮 疫病毒（Phocid distemper virus）。麻疹病毒属中 各病毒有抗原交叉，根据核蛋白编码基因的序列分析提示麻疹病毒接近于牛 疫病毒。麻疹病毒只有一个血清型。人类是麻疹病毒的储存宿主，麻疹病毒只 能自然感染人和一些类人猿。1954年Enders和Reebles第1 次用细胞培养技术从麻疹患者急性期血中分离到麻疹病毒。60年代初美国、 前苏联、日本和中国相继独自用本国（或他国）分离的麻疹野病毒研制成功麻 疹减毒活疫苗。1 麻疹病毒基因 麻疹病毒为单股RNA，负链，不分节段，基因组全长为15.894k b，其基因结构如图1所示。麻疹病毒有6个结构基因，编码6个主要结构蛋 白。从基因3′端开始依次为核蛋白（Nucleoprotein，N）、 磷酸蛋白（Phosphoprotein，P）、膜蛋白（Matrix protein，M）、血溶素也称融合蛋白（Fusion protei n，F）、血凝素蛋白（Hemagglutinin，HA），依赖于RN A的RNA聚合酶（Large protein，L）。另外两个非结构蛋 白V和C蛋白也由P基因编码，C和V两种蛋白功能尚不十分清楚。
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乙肝病毒肝源细胞培养模型的研究进展
乙型肝炎病毒感染可以引发慢性病毒性肝炎、肝炎肝硬化,甚至是肝细胞癌.全球约有3.5亿人感染慢性乙型肝炎病毒.随着分子生物学和细胞培养技术在乙肝病毒研究中的发展与应用,研究者们建立起了多种细胞模型.本文简要综述肝源细胞模型在乙型肝炎病毒研究中的应用进展.
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旋转细胞培养系统培养的山羊软骨细胞
目的 探讨用旋转细胞培养系统(RCCS)进行大动物软骨细胞扩增的可行性.方法 将单层培养的具有正常表型的中国山羊软骨细胞和Cytodex-3微载体放入RCCS的培养容器中,加入DMEM培养基进行培养.在细胞培养的第3、6、9、12天,于倒置显微镜下观察Cytodex-3微载体表面软骨细胞生长形态及增殖变化情况,并对收获的软骨细胞进行蕃红花"O"染色和Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色分析.结果 软骨细胞贴附于微载体表面生长,细胞初期呈球形、半球形凸起,逐渐向周围伸展,随时间的延长,贴附于微载体的细胞逐渐增多.收获的软骨细胞蕃红花"O"染色呈强阳性,Ⅰ型胶原染色呈阴性,Ⅱ型胶原染色则呈强阳性.结论 利用RCCS可简便快速地在体外扩增羊软骨细胞,培养的软骨细胞具有正常的表型,能特异性分泌软骨组织特有的基质成分.
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大鼠前脂肪细胞的原代培养分化
目的 建立一种简便的大鼠前脂肪细胞的原代培养方法.方法 无菌取成年Wistar大鼠的腹股沟纯脂肪颗粒,采用酶消化法进行原代培养.在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况,以油红O脂肪染色法进行原代培养细胞的鉴定.结果 培养细胞的形态学观察显示,脂肪细胞贴壁后初为类圆形,3 d后渐成梭形;7～8 d细胞增殖明显,形状由多角梭形变为椭圆形,并开始积聚脂肪颗粒;10 d后细胞呈椭圆形、圆形,胞内积聚大量脂肪颗粒.培养10 d的细胞经油红O染色后于普通光镜下观察,见细胞内出现红染颗粒,可以鉴定细胞分化为前脂肪细胞.结论 成功建立了大鼠前脂肪细胞的原代培养方法,为脂肪内分泌学研究提供了制备适用细胞模型的手段.
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红花细胞培养物化学成分研究
目的：研究红花细胞培养物的化学成分。方法采用固体 MS培养基，对红花细胞进行放大培养，通过硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、半制备 HPLC等方法对红花细胞培养物的化学成分进行分离纯化，质谱和核磁共振等波谱方法进行化学成分的结构鉴定。结果从红花细胞培养物中分离并鉴定了12个化合物，分别是豆甾-5-烯-3β,7β-二醇、豆甾-5-烯-3β,7α-二醇、豆甾-5,22-二烯-3β,7β-二醇、豆甾-5,22-二烯-3β,7α-二醇、十六烷酸甘油酯、丁香酸甲酯、3,5-二甲氧基-对羟基苯甲醛、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、N-阿魏酸酰-对羟基苯乙胺、芥子酸乙酯、丁香脂素。结论化合物豆甾-5-烯-3β,7β-二醇、豆甾-5-烯-3β,7α-二醇、豆甾-5,22-二烯-3β,7β-二醇、豆甾-5,22-二烯-3β,7α-二醇、丁香酸甲酯、3,5-二甲氧基-对羟基苯甲醛、N-阿魏酸酰-对羟基苯乙胺、芥子酸乙酯均为首次从红花植物中分离得到。
