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少加样高收效制备创伤修复剂纤维粘连蛋白的方法
背景:纤维粘连蛋白不仅对细胞起支架作用,而且是细胞间重要的连结因子,具有类似调理素作用,可促进单核吞噬细胞系的吞噬功能,在炎症和创伤中起修复作用.目的:以新鲜健康男性"O"型血浆为原料,为制备纤维蛋白结合素筛选出加样量小,方法简便、收得率高的纯化方法.设计:开放性实验.单位:广州市红十字会医院暨南大学第四附属医院创伤外科研究所.材料:实验于2000-07/2002-07在广州市红十字会医院创伤外科研究所完成.材料主要包括新鲜健康男性"O"型血浆、明胶、CNBr-activatedSepharose 4B、交联葡聚糖G-25、尿素、三羟甲基氨基甲烷等.方法:用明胶与溴化氰活化琼脂糖珠偶联的亲和层析柱对纤维蛋白结合素进行纯化.①加人血浆:取新鲜健康男性O型血浆150 mL,每次向柱内加入25 mL,停留20 min,流速3.5 mL/min.②去杂蛋白:用pH 7.5的Tris-柠檬酸钠平衡液洗柱,洗至流出液280nm下吸光度值＜0.02,再用含1 mol/L NaCl的Tris-柠檬酸钠洗去其他杂蛋白.③收集纤维蛋白结合素:用3 mol/L脲-Tris洗脱液洗柱,收集纤维蛋白结合素.④纤维蛋白结合素收集液去尿素:取纤维蛋白结合素的收集液,过SephadeG-25,去除尿素.⑤除菌:用0.22μm滤菌器过滤除菌.主要观察指标:①十二烷基黄酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果.②停留时间对提纯纤维蛋白结合素收得率的影响.③加入血浆量对提纯纤维蛋白结合素收得率的影响.结果:①十二烷基黄酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果:分离胶浓度为7%,浓缩胶浓度为3%,纤维蛋白结合素电泳结果为单一蛋白区带.②停留时间对提纯纤维蛋白结合素收得率的影响:血浆加样量为150 mL,柱内不停留和停留时间为10,20,30 min时纤维蛋白结合素收得率分别是(65.24±3.45)%,(74.77±4.05)%,(86.99±4.10)%,(80.47±3.75)%.③加入血浆量对提纯纤维蛋白结合素收得率的影响:柱内停留时间为20min时,血浆加样量为100,130,150,180mL时纤维蛋白结合素收得率分别是(72.56±3.63)%,(77.61±3.14)%,(86.99±4.12)%,(74.67±3.05)%.结论:在明胶亲和柱体积不变的条件下,制备纤维蛋白结合素的量与血浆加样量、血浆在柱内停留时间密切相关.明胶亲和柱的血浆佳加样量为150 mL,每次血浆在柱内停留时间应为20 min,此法制备的纤维蛋白结合素加样量小,收得率高.
关键词： 纤维蛋白 结合素类/生物合成 纤连蛋白类/生物合成
