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少加样高收效制备创伤修复剂纤维粘连蛋白的方法
背景:纤维粘连蛋白不仅对细胞起支架作用,而且是细胞间重要的连结因子,具有类似调理素作用,可促进单核吞噬细胞系的吞噬功能,在炎症和创伤中起修复作用.目的:以新鲜健康男性"O"型血浆为原料,为制备纤维蛋白结合素筛选出加样量小,方法简便、收得率高的纯化方法.设计:开放性实验.单位:广州市红十字会医院暨南大学第四附属医院创伤外科研究所.材料:实验于2000-07/2002-07在广州市红十字会医院创伤外科研究所完成.材料主要包括新鲜健康男性"O"型血浆、明胶、CNBr-activatedSepharose 4B、交联葡聚糖G-25、尿素、三羟甲基氨基甲烷等.方法:用明胶与溴化氰活化琼脂糖珠偶联的亲和层析柱对纤维蛋白结合素进行纯化.①加人血浆:取新鲜健康男性O型血浆150 mL,每次向柱内加入25 mL,停留20 min,流速3.5 mL/min.②去杂蛋白:用pH 7.5的Tris-柠檬酸钠平衡液洗柱,洗至流出液280nm下吸光度值＜0.02,再用含1 mol/L NaCl的Tris-柠檬酸钠洗去其他杂蛋白.③收集纤维蛋白结合素:用3 mol/L脲-Tris洗脱液洗柱,收集纤维蛋白结合素.④纤维蛋白结合素收集液去尿素:取纤维蛋白结合素的收集液,过SephadeG-25,去除尿素.⑤除菌:用0.22μm滤菌器过滤除菌.主要观察指标:①十二烷基黄酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果.②停留时间对提纯纤维蛋白结合素收得率的影响.③加入血浆量对提纯纤维蛋白结合素收得率的影响.结果:①十二烷基黄酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果:分离胶浓度为7%,浓缩胶浓度为3%,纤维蛋白结合素电泳结果为单一蛋白区带.②停留时间对提纯纤维蛋白结合素收得率的影响:血浆加样量为150 mL,柱内不停留和停留时间为10,20,30 min时纤维蛋白结合素收得率分别是(65.24±3.45)%,(74.77±4.05)%,(86.99±4.10)%,(80.47±3.75)%.③加入血浆量对提纯纤维蛋白结合素收得率的影响:柱内停留时间为20min时,血浆加样量为100,130,150,180mL时纤维蛋白结合素收得率分别是(72.56±3.63)%,(77.61±3.14)%,(86.99±4.12)%,(74.67±3.05)%.结论:在明胶亲和柱体积不变的条件下,制备纤维蛋白结合素的量与血浆加样量、血浆在柱内停留时间密切相关.明胶亲和柱的血浆佳加样量为150 mL,每次血浆在柱内停留时间应为20 min,此法制备的纤维蛋白结合素加样量小,收得率高.
关键词： 纤维蛋白 结合素类/生物合成 纤连蛋白类/生物合成 -
两种不同消化方法对表皮细胞表面抗原α6整合素和转铁蛋白受体表达的干预
目的:采用单纯胰酶和中性蛋白酶联合胰酶两种不同的消化方式,观察表皮细胞表面抗原α6整合素和转铁蛋白受体CD71表达的变化,为荧光激活细胞分选术分选表皮干细胞选择合适的消化方法.方法:选取中山大学附属第一医院外科门诊包皮环切手术患者的皮肤标本10份,患者均知情同意,年龄14～22岁.每份标本均分为2份,分别用胰酶、中性蛋白酶联合胰酶进行消化,共20份,分为胰酶组、中性蛋白酶联合胰酶组,10份/组.胰酶组将皮条放入质量浓度为2.5g/L的胰酶中,4℃消化过夜.次日撕除表皮角质层,以弯镊轻刮皮肤上皮面,获得表皮基底层细胞;中性蛋白酶联合胰酶组将皮条放入质量浓度为2.5g/L的中性蛋白酶中,4℃消化过夜.次日轻撕下皮肤表皮层,将其剪成1 mm×1 mm大小的碎块,以质量浓度为2.5g/L的胰酶消化5 min,获得表皮基底层细胞.分别取两组细胞悬液300 μL,加入碘化丙啶标记死亡细胞,流式细胞仪检测死亡细胞百分率,计算细胞活力.以荧光标记的α6整合素和CD71抗体标记细胞表面抗原,通过流式细胞术检测抗原表达.剩余细胞以表皮细胞培养液重悬,移入预先铺有100 mg/LⅣ型胶原的培养瓶中,接种密度为5×104/cm2,3 d换液1次,观察两组细胞的生长情况.结果:实验纳入包皮环切手术患者的皮肤标本10份,每份标本分别用胰酶、中性蛋白酶联合胰酶进行消化,共20份,全部进入结果分析.①不同酶消化后两组细胞活力的比较:中性蛋白酶联合胰酶组细胞活力明显高于胰酶组[(86±1.81)%,(82±1.48)%,P＜0.01].②不同酶消化后两组细胞抗原的表达:胰酶组α6briCD71dim细胞占(8.00±1.69)%,α6briCD71bri细胞占(36.00±18.03)%,α6dim细胞占(40.00±10.08)%;中性蛋白酶联合胰酶组3种细胞所占比例依次为(30.00±8.59),(8.00±1.63),(38.00±8.72)%,两组各抗原的表达基本相似(P＞0.05).③不同酶消化后两组细胞形态学观察结果:胰酶组细胞贴壁及伸展较中性蛋白酶联合胰酶组稍迟0.5～1.0 h,此后培养过程中生长增殖情况无明显差异,一般7 d左右接近融合,传代.培养第7天,表皮细胞体积小,核浆比例大,可见夹杂有成纤维细胞.中性蛋白酶联合胰酶组细胞30 min内基本贴壁,并有少量细胞伸展,60 min后大部分细胞伸出短小伪足,胞质展开,折光率减低.培养第7天,表皮细胞体积小,核浆比例大,未见夹杂有成纤维细胞.结论:从对表面抗原表达影响的角度来看,单纯胰酶消化与中性蛋白酶联合胰酶消化后α6briCD71 dim,α6briCD71bri,α6dim这3种表皮细胞的检出率基本相似,两种消化方法可根据习惯选用.但中性蛋白酶联合胰酶消化对细胞活力影响小,消化时机容易掌握,对细胞损伤相对小,适用于荧光激活细胞分选术分选表皮干细胞.
