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小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性和相关基因的表达
目的:观察小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性并检测其相关基因的表达.方法:实验于2005-02/06在暨南大学医学院中心实验室进行.①取妊娠13.5 d昆明小鼠分离胚胎大脑中的神经干细胞,用添加碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基进行体外培养,取培养3 d的神经球接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶,用含血清的培养基诱导分化.②免疫细胞化学检测细胞表面抗原.③四甲基偶氮唑盐法绘制生长曲线.④流式细胞术检测细胞周期.⑤反转录-聚合酶链反应和免疫细胞化学技术对神经干细胞进行鉴定.结果:①胚胎神经干细胞及其分化细胞的抗原表达:血清诱导8 h,分化细胞中(8.9±5.6)%细胞呈Tubulin阳性,(87.5±7.4)%细胞胞浆呈胶质纤维酸性蛋白阳性表达.未诱导细胞近100%呈巢蛋白阳性,仅有极少数细胞Tubulin阳性或胶质纤维酸性蛋白阳性.②胚胎神经干细胞的细胞周期:从小鼠胚胎大脑获取的神经干细胞3 d左右进入指数生长期;原代培养细胞83.8%处于静止期/DNA合成前期.③原代与传代细胞均表达巢蛋白mRNA,聚集形成的神经球巢蛋白阳性.血清诱导4 h胚胎神经干细胞开始转录神经元相关基因Tau和胶质细胞相关基因胶质纤维酸性蛋白.结论:从小鼠胚胎大脑可成功分离获得大量胚胎神经干细胞,并在含碱性成纤维细胞生长因子的条件培养基中迅速增殖,血清诱导下分化生成神经元和星型胶质细胞.
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高温和香烟对鼠早期胚胎脑蛋白质及热休克蛋白的影响
背景:应用分子生物学技术与体内/外实验动物模型结合手段,从发育学角度探讨了热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)与胚胎生长发育和畸形发生的内在联系,为充实和推动从分子水平揭示胚胎发育正常或异常的奥秘开辟了一条新的途径.目的:探讨高温、香烟及联合对鼠胚胎脑HSP70及蛋白质合成的影响.设计:随机对照的实验研究.地点、材料和方法:实验在新乡医学院细胞生物学教研室和实验动物中心完成.实验选用SD雄性大鼠100只,雌性大鼠200只合笼过夜,按随机抽签法将150只孕鼠分为高温和高温与香烟联合组,高温组分为37,40,41,42℃4个大组,每一大组随机分为处理时间为1,2,3,4,5 min小组,共20组;高温与香烟联合组分为37和42℃两大组,每一大组再分为皮下注射相当于0,0.5,1.0,1.5,2.0支香烟5个小组,共10组.高温组于孕鼠孕第10天进行高温处理,高温与香烟联合组于孕鼠孕第2天进行香烟处理,各组孕鼠高温处理,2 h后处死,取胎鼠全脑组织制备匀浆,测量HSP70和蛋白质含量,观察高温及高温+香烟各组胎鼠大脑蛋白质含量及诱导合成的HSP70的含量.主要观察指标:高温、高温与香烟联合对胎鼠脑蛋白质及HSP70变化的影响.结果:高温(40,41,42℃)导致胎脑蛋白质含量从7.01 mg下降到5.66mg,与对照组(37℃)比较,差异有显著性意义(F=3.92,P＜0.01),并与温度持续时间呈正相关;同时可诱导HSP70的合成,40,41℃及42℃高诱导量分别为57.3,71.3,83.2 mg/g,41℃持续3 min以上组及42℃各组与对照组比较有显著性差异(F=4.02,P＜0.01);高温+香烟(1.0,1.5和2.0支)组胎脑蛋白质含量分别降到5.31,5.24,5.09mg,与单独高温组比较(42℃持续5 min)胎脑蛋白质含量有明显变化(F=4.45,P＜0.01);诱导HSP70合成量与单独高温组比较未见明显变化(F=1.05,P＞0.05).结论:高温、香烟烟雾及其联合可引起胎脑蛋白质含量减少,并诱导脑HSP70合成,但香烟的诱导作用较高温弱,与高温联合胎脑HSP70合成表现出交叉适应性反应.
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应用神经轴突示踪技术研究人类视觉神经通路胚胎发育
目的:应用神经轴突示踪方法,研究人类视觉神经通路在胚胎期12 w时的发育情况.方法:取12 w胎龄的胚胎,浸泡在4%的甲醛缓冲液中固定后,分别在视束、上丘臂和视皮质下植入DiI染料(DiI,1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylin-docarbocyanine perchlorate).于室温下放置4 w,待DiI晶体充分扩散后,根据神经轴突方向切片,通过共焦激光扫描显微镜观察并记录结果.结果:大体标本观察可见到,视网膜神经纤维投射已到达外侧膝状体、上丘.切片观察发现:外侧膝状体处尚未出现分层现象;上丘处,来自视网膜的神经纤维位于上丘臂的背侧;视皮质下已存在板层结构,板层内神经元呈多种形态.结论:通过神经轴突示踪技术发现,12 w时视网膜的神经纤维投射已经到达外侧膝状体和上丘,视皮质下存在板层结构.这说明人类视觉神经通路发育存在"等待期".
