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结核分枝杆菌UDP-N-乙酰葡糖胺生物合成及抗结核药物靶标
结核分枝杆菌是结核病的致病菌.UDP-N-乙酰葡糖胺是结核分枝杆菌细胞壁的重要糖基供体及前体分子,其生物合成由三种酶催化的四步反应完成.磷酸葡糖胺变位酶GlmM催化第二步反应,GlmU双功能酶催化后两步反应.glmM及glmU基因敲除分别导致细菌细胞壁受损、细菌裂解及死亡,因此,GlmM和GlmU可作为研发抗结核新药的作用靶标.建立GlmM及GlmU酶活性检测方法、揭示其酶学特性、解析GlmU的晶体结构,便于人们筛选及定向设计酶抑制剂,以期发现新一代抗结核药物.
关键词： 结核病 结核分枝杆菌 UDP-N-乙酰葡糖胺 GlmM GlmU -
glmU基因敲除后对分枝杆菌细胞壁中聚糖影响的初步分析
应用已构建的glmU基因敲除的耻垢分枝杆菌作为实验模型,对细胞壁中的聚糖的组成成份和结构进行分析.气相色谱与高效液相Dionex的结果共同说明了在mc2155 glmU KOT菌株的细胞壁内,当缺失活性GlmU时,阿拉伯糖含量增加,且其增加是来自于具有分支的阿拉伯糖末端的增多.此结果将能更进一步地认识GlmU的功能以及当GlmU功能异常时对细菌造成的影响,这些都将为研究以GlmU为靶位点的药物对细菌的影响提供实验支持.
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用PCR方法定向突变结核分枝杆菌glmU基因
目的:结核分枝杆茵glmU基因是分枝杆菌生长必需基因,其编码产物具有乙酰基转移酶活性和尿嘧啶转移酶活性,参与细胞壁前体物UDP-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)的生物合成,研究其空间结构可以定向设计酶抑制剂.方法:利用PCR方法定向突变结核分枝杆菌glmO基因,并用大肠杆菌BL21(DE3)高表达m-GlmU蛋白.结果:获得了定向突变的结核分枝杆菌glmU基因,m-glmU.纯化的m-GlmU蛋白仍具有乙酰基转移酶活性和尿嘧啶核苷转移酶活性.结论:纯化的m-GlmU蛋白为进一步研究其稳定性、测定其空间结构提供了物质基础.
关键词： 结核分枝杆菌 细胞壁 UDP-GlcNAc GlmU -
耻垢分枝杆菌glmU基因克隆、表达及多克隆抗体的制备
目的:制备抗耻垢分枝杆菌(Smeg)GlmU的多克隆抗体,并对其特异性进行鉴定.方法:用PCR技术扩增SmegglmU,构建可在大肠杆菌中表达的重组质粒pET29b-SmegglmU,用IPTG诱导表达,经Ni-NTA-Agarose柱层析纯化后,以其为免疫原制备抗Smeg GlmU的多克隆抗体,并以间接ELISA方法测定抗体效价,以Western blot方法鉴定抗体的特异性.结果:在大肠杆菌中得到了可溶性表达的Smeg GlmU;以其免疫小鼠获得抗血清,Western blot鉴定显示获得了能特异性地作用于耻垢分枝杆菌GlmU的多克隆抗体,ELISA测定表明其效价高于1:6 400.结论:获得了能特异性地作用于耻垢分枝杆菌GlmU的高效价多克隆抗体,为应用反义RNA技术研究glmU基因的功能奠定了基础.
