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制作无支持膜切片的几点体会
随着人们对细胞超微结构研究的需要,特别是细胞免疫化学做酶标、金标的电镜切片越来越多,这样对超薄切片的分辨率、反差及污染程度的要求越来越高.总结近几年切片及透射电镜下观察的经验,发现把切片裱在无支持膜的铜网上,比裱在有支持膜的铜网上,图象清晰、分辨率高、容易着色、污染少等优点,并省略了做膜的烦琐过程.同时酶标或金标的反应效果也好得多.但要制作好的无膜切片,要注意以下几点.
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支持膜制备方法的改进
在电子显微镜技术中,观察样品需要放置在支持膜覆盖的铜网上,支持膜的好坏就决定了样品的质量.支持膜常规制备方法很不理想,出膜率低,厚薄不均.因此我们对常规制备方法加以改进,并取得了满意的效果.
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透射电镜超薄切片前期载网清洗方法
在透射电镜生物样品的制备与观察中,要经过取材、固定、漂洗、脱水、修块、定位、超薄切片、染色等一系列繁复的程序,所有步骤环环相扣,缺一不可.超薄切片需被捞取在特殊的载网上才可进行透射电镜观察,而制作载网的材料一般为铜,因此也将载网称为铜网.
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免疫胶体金在标记超薄切片中抗原的几点体会
金标法是利用胶体金在碱性环境中带负电的性质,使其与抗体相吸引,从而将抗体标记.我们在使用免疫胶体金标记超薄切片抗原的实验中深深地体会到,要提高标记阳性的成功率,某些因素将在实验中起到很重要的作用.1、材料和方法1.1材料 20例通过光镜、免疫荧光、电镜诊断为IgA肾病的肾活检组织的环氧树脂包埋块.1.2方法取肾活检组织,经0.05%戊二醛,1%多聚甲醛(二甲砷酸钠缓冲液配制)固定3-4h,1%OsO4后固定2h,梯度丙酮脱水,Epon812包埋,60℃聚合12h,制备超薄切片(50-70nm),粘贴于带有formar膜的镊网上.以下实验在湿盒内进行:10%H2O2蚀刻30min,双蒸水冲洗;正常羊血清30m in;0.05M TBS冲洗;一抗((1:10)4℃冰箱内孵育20h,加室温2h; 0.05M Tris冲洗;正常羊血清孵育15min;0.05M Tris冲洗,0. 02M Tris(其中含0.1%BSA 0.05%NaN3pH8.2)冲洗;二抗 (1:20),室温孵育2h;0.02M Tris冲洗,0.05M Tris冲洗, 0.05M Tris加Tritonx-100浸洗,3次每次10min,双蒸水冲洗 ;1%戊二醛固定15min,双蒸水冲洗;铅铀双重染色,电镜观察.2、结果金颗粒主要集中于肾小管上皮细胞的胞质,有的沉积在线粒体内,或刷状缘其间 .详细内容见(用金标法检测细胞因子在人IgAN肾细胞内的位点及意义)金晓明等一文.3、体会和注意事项3.1 戊二醛的浓度直接影响抗原的保存.我们经过多次实验,戊二醛浓度在0.05%, 多聚甲醛1%时,固定时间不少于3小时,组织大小在1-2mm3,组织结构保存良好 ,同时对抗原影响也不大.3.2 抗体的稀释液采用0.05M Tris,0.15M NaCL,pH7.0,含 0.05%聚乙二醛(PEG)和0.05%NaN3.其中PEG可以使金颗粒分散, 提高蛋白质间的结合力,有利于一抗与二抗的结合,血清和BSA作为稀释液时都没有PE G效果好.一抗与二抗的稀释比例根据所标记抗原的情况而定.3.3 Triton x-100加入到0.05M Tris缓冲液中作为冲洗液,可以提高胶体金的穿透力,同时Triton x-100又是一种表面活性剂,在2抗标记后用含有0.05Triton x-100的Tris缓冲液浸洗30min,可以清除一部分非特异性反应的胶体金,使切片中组织形态清晰,提高样品的反差,而过量浓度的Tri ton和过长时间的浸洗会破坏组织中的膜结构.3.4 在实验中采用网架装载铜网,一次可以同时孵育几张到几十张超薄切片,同时不用担心在孵育过程中切片的正反面,又可避免镊子夹破支持膜和切片,节省每一实验步骤中的操作时间.网架是用铜网装载盒制成的,钻漏铜网盒,按所需的大小锯成小网架.清洗时用浓盐酸浸泡几分钟后冲洗,放在无水乙醇中保存,待下次使用前晾干.
