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Streptomyces griseochromogenes菌株milbemycin生物合成基因簇的筛选
经Bam HI酶切的柯氏质粒pku403与Mbo Ⅰ部分消化并经碱性磷酸酶处理的Streptomyces griseochromogenes染色体DNA片段相连接,体外包装后,转化大肠杆菌E.coli JM108,挑取转化子1 152个,构建Streptomyces griseochromogenes的基因文库.分别以avermectin聚酮体合成酶(PKS)的酰基转移酶基因(AT)、酮基合成酶基因(KS)及参与avermectin生物合成的内酯化酶基因(aveE)、C5-O-甲基转移酶基因(aveD)为探针,利用菌落原位杂交、核酸杂交和以烯酰基还原酶基因(ER)引物的PCR扩增等手段,从文库中筛选出24个阳性克隆.根据克隆DNA之间的重叠关系,将阳性克隆分为7组,这7组阳性克隆群可能覆盖控制milbemycin生物合成的基因簇.
关键词: 柯氏质粒pku403 包装蛋白 转化 基因文库 聚酮体合成酶(PKS) 菌落原位杂交 核酸杂交 PCR -
东方拟无枝酸菌中ECO-0501生物合成基因簇的筛选及其相关调控基因的初步分析
ECO-0501是从东方拟无枝酸菌代谢物中分离到的一种新型线性多烯类化合物,其不但具有良好的抗菌活性,且体内毒性较低,目前处于临床前的开发.本文通过对东方拟无枝酸菌的菌落原位杂交,筛选到4个粘粒克隆NL5B,NL9-3-1,NL3-1C,NL3-3A,可以覆盖整个ECO-0501生物合成簇,并对其中的基因ORF4进行了生物信息学分析,推测其为ECO-0501合成途径中的正调控基因.并通过该基因的过表达,成功地将ECO-0501的产量提高了6倍,为下一步ECO-0501的开发及其调控机制的研究打下基础.