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体外转录翻译文献资料
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跨膜突变型TNF-α的基因构建及体外表达
目的:跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)易在某些蛋白酶的作用下转换为分泌型TNF-α(S-TNF-α).拟用基因突变技术获得稳定表达的、不能转换成S-TNF的TM-TNF突变体(TM-TNFm).方法:应用RT-PCR技术,从人外周血单核细胞中扩增出编码TM-TNF-α的全长cDNA序列并构建pBSK-TNF-α重组体.以此为模板,借助改进的"一次重组PCR"定位突变技术,造成TM-TNF转换为S-TNF酶切位点的缺失,获得TM-TNF突变重组体(TM-TNFm).结果:将TM-TNFm cDNA片段克隆至表达载体pGEM-3Zf,利用体外转录翻译系统表达出具有生物学活性的跨膜突变型TNF-α蛋白.经Western blot分析证实,用胶原酶不能将TM-TNF突变体酶解成为S-TNF.结论:提示所构建的TM-TNFm去除了可转换为S-TNF的酶解氨基酸序列,为进一步研究跨膜型TNF杀瘤作用奠定了基础.
