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多特异性内参照模板文献资料
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多特异性内参照模板的构建及应用
目的:构建多特异性内参照模板,用于Fas、FasL、GB、P、TIA-1和β-actin的竞争性PCR定量.方法:体外合成DNA单链,PCR扩增后,得到2个片段.片段1长145 bp,含有Fas、FasL、GB、P、TIA-1和β-actin的5′引物序列;片段2长147 bp,含有相同基因的3′引物序列.将片段1、2分别克隆在载体PKF3上.结果:克隆载体经酶切鉴定及DNA序列测定,证实为本实验所设计的多特异性内参照模板,以此为模板,用不同的引物进行PCR扩增,即可得到相应的竞争内参照.应用多特异性内参照模板对移植肾急性排斥患者外周血淋巴细胞中TIA-1进行定量,结果显示,底物量在一定范围内,靶序列和竞争性内参照模板的扩增效率基本一致,尤其是在指数期.这一结果同样适用于Fas、FasL、GB、P和β-actin的定量.结论:本实验构建的多特异性内参照模板可用于6种基因的竞争性PCR检测,为进一步研究打下了基础.
