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乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因对肺腺癌A549细胞周期及增殖的影响
目的 构建乏氧(HRE)/辐射(Egr1)双敏感启动子介导的分泌型人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)(shTRAIL)基因表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,观察其对肺腺癌A549细胞周期及增殖的影响.方法 利用化学合成HRE上、下链,PCR扩增得到双链HRE;利用基因重组技术构建含有HRE/Egr1双敏感启动子介导shTRAIL的表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,经酶切、PCR和测序鉴定正确后,干扰质粒经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞,MTT法检测A549细胞增殖的变化,流式细胞术检测A549细胞周期的变化.结果 BamH I和Sma I酶切,所得片段大小分别为1 284 bp和4 998 bp、2 292 bp和3 990 bp;以载体为模板,Egr1和shTRAIL引物进行PCR扩增,可得到469 bp和820 bp产物;将pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL进行测序,所得结果与设计一致,说明构建正确.转染肺腺癌A549细胞后,乏氧与辐射能够降低细胞增殖能力,增加G0/G1和S期细胞百分比,降低G2/M期细胞百分比(P＜0.05,P＜0.01),二者联合作用更明显.结论 乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因在乏氧和/或辐射条件下能够延长细胞G0/G1和S期,缩短G2/M期,并且抑制肺腺癌A549细胞增殖能力,二者协同作用更明显.
关键词： 乏氧/辐射 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL) 增殖 周期 -
乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因载体的构建及表达
目的:构建乏氧(HRE)/辐射(Egr1)双敏感启动子介导的分泌型人TRAIL(shTRAIL)基因表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,观察乏氧和辐射对其表达的影响.方法:利用化学合成HRE上、下链,PCR扩增得到双链HRE;pMD19T-Egr1经Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切得到Egr1;pshuttle-shTRAIL经Kpn Ⅰ和BarnH Ⅰ双酶切得到shTRAIL;利用基因重组技术构建含有HRE/Egrl双敏感启动子介导shTRAIL 的表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,经酶切、PCR和测序鉴定正确.肺腺癌A549细胞分为正常组、乏氧组(1%)、照射组(6 Gy)和乏氧加照射组;表达载体转染肺腺癌A549细胞,RT-PCR及ELISA法检测shTRAIL的表达.结果:BamH Ⅰ和Sma Ⅰ酶切,所得片段大小分别为1 284和4 998 bp、2 292和3 990 bp;以Egr1和shTRAIL引物PCR扩增该载体,得到469和820 bp产物;将pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL进行测序,所得结果与设计一致,说明构建正确.转染肺腺癌A549细胞后,乏氧组、辐射组及乏氧加照射组shTRAIL mRNA和蛋白表达增加,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05),且乏氧加照射组表达更明显.结论:成功地构建了乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因表达的载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL;乏氧及照射能够诱导TRAIL表达增加,且二者具有协同作用.
关键词： 乏氧/辐射 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 基因重组
