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肝细胞损伤条件培养基对大鼠骨髓间充质干细胞肝向分化的促进作用
目的：制备肝细胞损伤条件培养基（CM），体外模拟损伤组织微环境，探讨其对大鼠骨髓间充质干细胞（BMMSCs）肝向分化的作用。方法：取1周龄乳鼠，经差时贴壁和差速梯度法结合优化梯度离心和贴壁换液时间分离培养BMMSCs。取6～8周龄大鼠，腹腔注射60％四氯化碳溶液（0.75 mL· kg－1）制备肝细胞损伤组织匀浆上清（CM1）和肝细胞损伤血清（CM2）。将第3代（P3）BMMSCs 随机分为0％CM组（对照组，采用10％FBS L-DMEM培养）、10％CM1组、20％CM2组和10％CM1＋10％CM2组。倒置显微镜下观察细胞形态表现，免疫组织化学法检测各组BMMSCs表面标志物 CD105和各组细胞中白蛋白（ALB）的阳性表达率，油红 O染色法检测BMMSCs成脂分化的脂滴形成阳性率；RT-PCR法检测各组细胞中甲胎蛋白（AFP）和 ALB的表达水平，糖原染色法检测细胞中糖原合成阳性率，鉴定并比较各组 BMMSCs肝向分化能力。结果：骨髓细胞原代培养72 h，贴壁细胞呈圆形或梭形，铺满瓶底时呈均匀有序的成纤维梭形状，P3 BMMSCs表面标志物CD105呈阳性表达。P3 BMMSCs经地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和消炎痛（DX＋IBMX＋IS＋ID）联合诱导后4 d，镜下可见脂滴形成。P3 BMMSCs经 CM诱导后细胞中 AFP和 ALB呈阳性表达，细胞糖原染色呈阳性。诱导后7 d，含CM成分的3组BMMSCs 中均可见细胞胞浆内容物变得丰富，细胞呈圆形、三角形或肝板样排列；诱导后7、14和21 d，与对照组比较，含CM成分的3组BMMSCs中ALB阳性表达率均明显增加（P＜0.01）；10％CM1＋10％CM2组 BMMSCs 中 ALB 阳性表达率高于10％CM1组和20％CM2组（P＜0.05）。诱导后7和14 d，与对照组比较，含CM成分的3组BMMSCs中糖原合成阳性率均明显增加（P＜0.01）；10％CM1＋10％CM2组 BMMSCs 中糖原合成阳性率高于10％CM1组和20％CM2组（P＜0.05）。结论：CM1和CM2可诱导大鼠BMMSCs向肝细胞分化，在达到相同诱导作用效果时所需的 CM1和 CM2浓度更低；CM1和CM2提供的微环境更有利于BMMSCs向肝细胞分化，其诱导细胞分化效率更高。
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BMSCs肝向分化过程中相关信号通路的研究进展
肝细胞生长因子(HGF)作为一种多效性的细胞调控因子,通过与肝细胞生长因子受体c-Met结合激活下游多种信号路径.HGF对信号路径的激活效果与骨髓干细胞(BMSCs)的分化密切相关.本文综述了HGF对BMSCs向肝细胞诱导分化所涉及信号通路的研究进展,为促进肝脏恢复治疗提供参考.
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骨髓间充质干细胞体外培养及肝向分化方案的优化
目的 优化一套简便、可靠、稳定的大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养、鉴定及肝向分化的方案.方法 采用全骨髓差速贴壁法分离提取大鼠骨髓间充质干细胞,通过优化的1.5 h差速贴壁结合12 h首次全量换液方法,及体外改良培养方案实现细胞高效纯化扩增.流式细胞术表面标志物检测结合成脂、成骨、成软骨诱导分化鉴定细胞群.采用添加bFGF、HGF、EGF等多种生长因子的三步诱导法促使骨髓间充质干细胞向肝系分化,并进行形态学、免疫学、基因水平评估.结果 分离纯化的细胞群阳性表达CD29、CD44、CD90,阴性表达CD34、CD45,经成脂、成骨、成软骨诱导液作用后,油红O、茜素红、甲苯胺蓝染色均呈阳性.经三步法肝向诱导处理后,细胞群呈肝样细胞形态改变,表达肝脏特异性标志物ALB、AFP,肝系相关基因表达水平呈时间依赖性逐渐上升.结论 优化后的方案能够简便、可靠、稳定地获得高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞,并能在特定微环境作用下实现肝向分化.
