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PPE68/Ipr1真核共表达质粒的构建及鉴定
目的 构建结核分枝杆菌PPE68基因和小鼠胞内病原体抗性基因1(Intracellular pathogen resistance 1,Ipr1)的真核共表达质粒,并在小鼠巨噬细胞BAW264.7中表达.方法 将结核分枝杆菌PPE68基因和小鼠Ipr1基因分别亚克隆至含多启动子的共表达载体pBudCE4.1中,构建真核共表达质粒pBud68-Ipr1,转染RAW264.7细胞,通过RT-PCR及Western blot 法检测PPE68和Ipr1基因的转录和表达.结果 重组表达质粒pBud68-Ipr1经PCR、双酶切及测序证实,插入的PPE68和Ipr1基因片段序列正确;质粒转染RAW264.7细胞后,PPE68和Ipr1基因进行了转录和表达,基因编码产物相对分子质量分别为37 000和50 000.结论 已成功构建了真核共表达质粒pBud68-Ipr1,并在RAW264.7细胞中获得表达,为PPE68/Ipr1重组BCG的构建及其免疫保护作用的进一步研究奠定了基础.
关键词： 结核病 PPE68 胞内病原体抗性基因1 巨噬细胞 -
Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒的构建及其在人肺癌细胞中的表达
目的 构建胞内病原体抗性基因1(Ipr1)和绿色荧光蛋白(GFP)基因真核共表达穿梭质粒,并在人肺腺癌细胞A549中表达.方法 采用PCR方法,分别从质粒pEGFP-C1-Ipr1和pEGFP-C1中扩增Ipr1和GFP基因,将GFP基因、分枝杆菌复制子OriM和Ipr1基因同时克隆入多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,构建pBud-GFP-OriM-Ipr1穿梭质粒,脂质体法转染A549细胞,荧光显微镜观察GFP的表达,免疫组化方法检测Ipr1蛋白的表达.结果 酶切和测序分析表明,pBud-GFP-OriM-Ipr1真核共表达穿梭质粒构建正确.转染A549细胞后,荧光显微镜下可观察到转染细胞中有GFP表达,免疫组化法可检测到Ipr1蛋白的表达,且定位于细胞核内.结论 已成功构建Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒,为进一步研究Iprl抗结核的功能奠定了基础.
关键词： 胞内病原体抗性基因1 绿色荧光蛋白 穿梭质粒 共表达 肺癌细胞
