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牛血清IgG双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立及应用
目的 建立牛血清IgG(bovine immunoglobulin G,BIgG)抗原的双抗体夹心ELISA定量检测方法.方法 用BIgG-Fc免疫BALB/c小鼠,制备抗BIgG单抗,确定包被抗体及酶标抗体后,建立定量检测BIgG抗原的双抗体夹心ELISA方法,并验证该方法的准确度、精密度、稳定性、特异性,确定该方法的线性范围和定量限度.应用建立的方法检测不同厂家、不同批次牛血清及纯化EV71样品中BIgG抗原残留量.结果 建立了以3EI2D2为包被单抗(8.0 μg/ml,100μl/孔),4A2GIBI-HRP为酶标抗体(1∶1000稀释,100μl/孔)定量检测BIgG的双抗体夹心ELISA方法,该方法的线性范围为0.3～9.6 ng/ml,R2＞0.99,定量限度为0.3 ng/ml;回收率在94.1％～108.5％之间,同一实验者重复检测和不同实验者检测的变异系数均＜10％;37℃放置3和6d的稳定性均＞90％;该试剂样品与BIgG可发生特异性反应,与其他动物源血清无交叉反应.9批牛血清中BIgG含量均存在差异;精纯样品较粗纯样品BSA和BIgG均明显去除,但BIgG占牛血清残留量(BSA+ BIgG)的比例却明显上升.结论 建立的BIgG抗原的双抗体夹心ELISA方法符合定量检测需要,可用于牛血清的质量质控及残留量检测.
关键词： 牛血清IgG 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA -
抗牛血清IgG单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定
用牛血清IgG免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用含山羊血清的培养基培养细胞,上清用间接ELISA法筛选.获得4株能稳定分泌抗牛血清IgG的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为1G5、2A8、3F5、4C5.其中2A8为IgG2a,其余3株为IgG1；腹水单抗的ELISA滴度均超过10-5;除3F5株单抗与山羊血清有交叉反应外,1G5、2A8、4C5株与人、马、猪、羊、兔、豚鼠等血清均不发生交叉反应；4株单抗与制备病毒性疫苗的基质液呈阴性反应；4株单抗识别分子量为160kD的牛血清lgG的两个不同抗原表位；4株单抗相对亲和力大小依次为4C5 ＞2A8 ＞1G5 ＞3F5,相对敏感度依次为2A8 ＞4C5 ＞3F5 ＞1G5;4株杂交瘤细胞株的染色体计数均大于90条,连续培养三个月以及冷冻保存半年后复苏,细胞生长良好.使用这些单抗建立的双抗体夹心法检测生物制品中的残留牛血清IgG.
