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小鼠SOCS1基因重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞中的表达
目的:构建含小鼠细胞因子信号抑制因子-1基因(SOCS1)的重组腺病毒载体(AdSF35-SOCS1),探讨其介导SOCS1基因在小鼠树突状细胞中的表达.方法:设计含AgeI和NheI酶切位点的SOCS1基因上下游引物,以质粒pEF-FLAG-1/mSOCS1为模版,通过PCR扩增获得SOCS1全部序列,片段回收后经AgeI和NheI酶切,再定向插入到经AgeI和NheI酶切的质粒pDC316-LacZa中,获得重组穿梭质粒pDC316-SOCS1,经AgeI和NheI酶切、PCR及测序等鉴定后,用脂质体将穿梭质粒pDC316-SOCSl与腺病毒骨架质粒pBHGF35共转染293细胞,经位点特异性重组获得重组腺病毒Ad5F35-SOCS1,行PCR鉴定,经293细胞扩增、纯化制备高滴度病毒液,TCID50法测定病毒滴度.用获得的重组腺病毒感染小鼠树突状细胞,以免疫组化检测SOCS1的表达.结果:成功构建了舍小鼠SOCS1基因的重组腺病毒栽体,病毒感染滴度为1.4×10IU/ml,该载体能有效介导SOCS1基因在小鼠树突状细胞中的表达.结论:重组腺病毒载体能将SOCS1基因转入小鼠树突状细胞并有效表达,为基因转染制备耐受性树突状细胞奠定了基础.
关键词： 腺病毒载体 细胞因子信号抑制因子-1 树突状细胞 -
细胞因子信号抑制因子-1沉默联合肿瘤抗原存活素及黏蛋白1负载的新型树突状细胞疫苗体外抗前列腺癌免疫效应
目的 通过沉默细胞因子信号抑制因子-1(SOCS-1)与负载肿瘤抗原存活素(Survivin)及黏蛋白1(MUC1)联合的方法构建新型树突状细胞(DC)疫苗,观察其体外抗前列腺癌(PCa)的免疫效应.方法 分离健康人外周血单个核细胞,体外诱导培养成DC,再以携有SOCS-1小干扰RNA(siRNA)及Survivin、MUC1融合蛋白的重组人5型腺病毒载体去感染DC(感染复数=1000).反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测感染后DC中SOCS-1、Survivin及MUC1的表达;流式细胞学分析DC表型分子人类白细胞抗原(HLA)-DR、CD83、CD1a、CD80和CD86;混合淋巴细胞反应检测其刺激T淋巴细胞增殖能力;酶联免疫吸附试验检测其分泌白细胞介素-12(IL-12)的水平,然后将DC与T细胞按1∶10比例共培养诱导成细胞毒性T细胞(CTL),乳酸脱氢酶释放法检测CTL分别在5∶1、10∶1、25∶1、50∶1等效靶比(E/T)下对PCa细胞的体外杀伤活性.结果 腺病毒感染DC效率为80％,感染后DC中SOCS-1表达受到明显抑制,Survivin及MUC1呈显性表达;成熟DC的表型分子HLA-DR、CD83、CD1a、CD80和CD86阳性率分别为(96.20±3.16)％、(75.20±2.63)％、(96.00±2.89)％、(96.80±2.77)％、(92.70±3.03)％,与未成熟DC组比较,表达显著增高,差异有统计学意义(P＜0.05).腺病毒感染组、阴性对照感染组及未感染组DC培养上清液中IL-12分泌水平分别为:(124.59±9.56)、(62.30±11.01)、(50.00±8.36) ng/L,可见新型DC疫苗IL-12分泌能力明显增强(P＜0.05);其诱导产生的CTL对PCa细胞DU-145的杀伤活性分别为:E/T=5∶1时为(22.56±1.23)％、E/T=10∶1时为(36.98±1.62)％、E/T =25∶1时为(55.40±2.96)％、E/T=50∶1时为(68.72±3.35)％,均明显高于对照组(P＜0.05).结论 沉默SOCS-1联合负载Survivin及MUC1的新型DC疫苗可有效诱导体外特异性抗PCa免疫效应.
关键词： 细胞因子信号抑制因子-1 存活素 黏蛋白1 前列腺癌 树突状细胞
