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Vsig4和免疫球蛋白Fc段融合蛋白的真核表达纯化
目的:本项目将通过构建中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)真核表达系统获取小鼠Vsig4膜外端和免疫球蛋白IgG3a-Fc段的融合蛋白,鉴定Vsig4-Fc和Vsig4纳米抗体的相互作用.方法:采用重合延伸PCR法融合小鼠IgG3a-Fc和Vsig4胞外段的基因序列,将该融合基因插入真核表达载体中并转染CHO细胞.Western blotting鉴定转染细胞上清中的目标蛋白,通过连续两次亚克隆筛选,获得高表达小鼠Vsig4-Fc融合蛋白的单克隆,之后大量培养增殖转染细胞并收集细胞培养上清,选择Protein A柱纯化方法纯化Vsig4-Fc蛋白,后经ELISA法鉴定Vsig4-Fc和纳米抗体的结合能力.结果:在CHO细胞中成功构建了小鼠Vsig4-Fc真核表达稳转系,并且在真核表达体系中获得可表达15 mg/L的双分子结构Vsig4-Fc的稳定转染细胞系.经鉴定小鼠Vsig4-Fc融合蛋白能与Vsig4纳米抗体结合.结论:重合延伸PCR法使得Vsig4和Fc基因片段的融合更为高效,两次亚克隆筛选优势细胞系大幅提高了真核蛋白的表达量,为进一步研究Vsig4的生物学功能奠定重要基础.
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HIV-1CRF01_AE重组型gp120 V1/V2结构域单克隆抗体的制备与鉴定
目的 真核表达人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1) CRF01_AE重组型gp120蛋白的V1/V2结构域,制备其单克隆抗体并鉴定其抗原反应性.方法 构建pTriEx-3-V1/V2CNE55真核表达载体,在HEK293F细胞中表达V1/V2-His融合蛋白,纯化后作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,ELISA筛选分泌抗V1/V2重组蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤,对单克隆抗体的特异性、型别以及效价进行鉴定.结果 制备并获得一株稳定分泌抗HIV-1 AE亚型V1/V2结构域单克隆抗体的杂交瘤细胞株,ELISA测定腹水效价高达1:81 000,单克隆抗体类型属于IgG1/κ型.Western blot结果表明该单克隆抗体同样能够识别不同亚型的HIV gp120蛋白.结论 成功制备出抗HIV-1 AE重组型gp120蛋白V1/V2结构域的单克隆抗体.
