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乙酰短杆菌中核苷磷酸化酶的性质研究
目的:以乙酰短杆菌完整细胞为酶源,研究不同条件下核苷磷酸化酶的性质.方法:将乙酰短杆菌湿菌体置于不同保藏温度及在不同种类缓冲溶液中考察其稳定性；在有或无核保护下核苷磷酸化酶对热的稳定性；并设计核苷的磷酸解反应或合成反应,测定核苷磷酸化酶的活力及酶促反应的表观米氏常数.结果:乙酰短杆菌中的核苷磷酸化酶经低温保藏可以保持较长时间的稳定性；菌体在60℃处理l小时即失去核苷磷酸化酶的活力,但是添加胸腺嘧啶有明显的保护作用；菌体中核苷磷酸化酶的合成能力明显大于磷酸解能力；对尿苷和5-甲基尿苷的表观米氏常数和大反应速率分别为16.7、11.4 mmol/L,0.0063、0.0041mmol/L.min.结论:含核苷磷酸化酶的乙酰短杆菌完整细胞作为酶源,在低温下可以长时间保藏,反应中的碱基对核苷磷酸化酶的抗热性有益,该菌种可以作为工业上核苷磷酸化酶的来源.
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细胞酶促转化过程中胸苷磷酸化酶(TPase)活性测定方法的研究
β-胸苷在乙酰短杆菌胸苷磷酸化酶的作用下,反应生成胸腺嘧啶.该文利用紫外分光光度法建立了细胞酶促转化过程中胸苷磷酸化酶活性的测定方法.β-胸苷在胸苷磷酸化酶作用下生成胸腺嘧啶,由于β-胸苷与胸腺嘧啶在300 nm处均有吸光度,反应后通过测量反应液300 nm处的吸光度,可测定反应中生成的胸腺嘧啶的量,从胸腺嘧啶的生成量的多少来判断胸苷磷酸化酶的活性.研究结果表明,在5％菌体浓度、10 mmol/L β-胸苷、0.1 mol/L的磷酸缓冲液(pH 6.9)中,37℃反应20 min,即可准确测定胸苷磷酸化酶的活性.利用上述方法测定胸苷磷酸化酶活性,活性能达80％,高于前人报道的方法所测得的酶活性.其中,乙酰短杆菌来源的胸苷磷酸化酶的表观米氏常数Km为11.9 mmol/L.
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乙酰短杆菌酶法合成2'-脱氧鸟苷
胸苷和鸟苷酸在乙酰短杆菌的核苷磷酸化酶和磷酸单酯酶作用下转化成鸟嘌呤、胸腺嘧啶、鸟苷和产物2'-脱氧鸟苷.通过考察菌体量、反应温度、反应pH值、底物浓度和磷酸盐浓度等参数,得到反应适条件为20 mmol/L的胸苷和鸟苷酸,30 mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.0),5%游离乙酰短杆菌在60℃下进行反应,经6 h胸苷转化率就可达到高为56.4%.反应液通过离子交换的方法进行分离,可以得到纯度90.2%的2'-脱氧鸟苷.
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核苷磷酸化酶的产酶条件优化的研究
以鸟苷和5-氟尿嘧啶为底物,乙酰短杆菌菌体为酶源酶法合成5-氟尿苷。采用酵母浸膏培养基（酵母浸膏4.0%，葡萄糖0.4%，NaCl 0.3％, pH7.0），较高的溶氧量，同时添加0.6%的豆油，培养12h, 产酶量可提高30%。
