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小鼠不同组织及缺氧损伤后的大鼠心肌细胞中RIP3的表达
目的:检测小鼠组织中受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族(RIPs)表达谱,并检测RIP3在大鼠心肌细胞缺氧损伤后的表达.方法:①采用荧光实时定量PCR分别检测RIPs家族基因在小鼠组织(心、肝、肺、肾、脑、小肠、骨骼肌、脾和主动脉)中的mRNA表达谱,并采用Western blot进一步检测RIP3在小鼠组织的蛋白表达谱.②将培养的大鼠心肌细胞分为缺氧组和对照组,缺氧组置于缺氧环境中培养48h,采用western blot检测其中RIP3的表达变化.结果:①mRNA水平:RIP1 mRNA在脑组织中表达高,心脏、肺、肾、骨骼肌较低;RIP2在心脏和肺表达量较其他组织高;RIP3在肠中表达较其他组织高出4倍以上,脑组织中未检测到RIP3表达;RIP4的表达以肺高,而骨骼肌、脑和血管中表达量低.②蛋白水平:在小鼠组织中,RIP3表达以脑、骨骼肌中高,心脏、肝、肺中表达较低.③培养的大鼠心肌细胞中,缺氧组心肌细胞的RIP3表达量显著高于对照组口＜0.05).结论:RIPs在小鼠组织中呈现差异表达,而在培养的大鼠心肌细胞缺氧损伤后RIP3表达升高.
关键词： 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族 心肌细胞 缺氧 坏死 -
人细胞增殖相关激酶plk3基因逆转录病毒载体的构建及对细胞增殖的影响
目的:构建人细胞增殖相关激酶基因plk3的逆转录病毒载体(RV),观察该基因对细胞增殖和细胞周期的影响.方法:将plk3基因亚克隆至pMSCV-puroR载体中,经酶切和测序鉴定,制备高滴度的RV,以流动感染法高效感染,半固体集落培养法测定基因导入率.用嘌呤霉素筛选后,获得K562-plk3-puroR和HL60-plk3-puroR细胞.以野生型细胞和导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞作为对照,用PCR鉴定基因的导入,并测定细胞周期及凋亡率等,研究plk3基因导入对细胞的影响.结果:获得pMSCV-plk3-puroR质粒并经酶切和测序证实.对K562和HL60细胞的基因导入率,分别达82.3%±3.70%和62.9%±4.94%(n=3).经嘌呤霉素筛选后,转基因细胞的阳性率>99%.K562-plk3-puroR和HL-60-plk3-puroR转基因细胞的增殖曲线比对照细胞降低(P<0.01);而导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞的增殖曲线与野生型细胞相比较无显著差异.与K562细胞相比较,常规培养时,处于G0～G1期的K562-plk3-puroR细胞增多[(49.7±3.38)% vs (43.9±2.34)%,P=0.03].以无血清培养基培养10 h后,进入S期的K562-plk3-puroR细胞减少[(43.6±3.74)% vs (54.5±1.52)%,P=0.02],凋亡率降低[(1.3±0.31)% vs (3.4±0.37)%,P=0.01].结论:构建了plk3基因的逆转录病毒载体,发现plk3基因的导入可延缓细胞增殖,并抑制细胞进入增殖周期.
关键词： 逆转录病毒载体 plk3基因 细胞周期 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族
