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慢病毒载体 Pwpi文献资料
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携带人二氢叶酸还原酶基因慢病毒表达载体构建及鉴定
目的:构建携带人二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的慢病毒表达载体pWPI.方法:采用PCR方法扩增二氢叶酸还原酶cDNA 全长,与EZ-T克隆载体连接,HindIII及BamHI-HF限制性内切酶双酶切回收的PCR片段并补平其缺口.慢病毒系统载体使用pWPI系统,采用PmeI酶切载体后回收片段,将其磷酸化,T4酶连接载体与目的基因.表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,重组质粒采用脂质体转染293T包装细胞后获得包装的病毒颗粒.结果:成功扩增二氢叶酸还原酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体DHFR-pWPI,重组质粒测序结果显与DHFR基因的同源性达100％,按标准生产程序转染293T后有DHFR基因的表达.结论:成功采用慢病毒载体系统构建了二氢叶酸还原酶重组慢病毒转基因,为探讨DHFR在肿瘤多药耐药过程中的分子机理奠定基础.
关键词： dhfr 慢病毒载体 Pwpi 293T 细胞
