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蔗糖磷酸化酶全细胞催化AA-2G的条件优化
目的:使用表达蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7,Sucrose phosphorylase,SPase)的大肠杆菌重组工程菌E.coli BL21/pET-spase,作为全细胞催化剂,合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(Ascorbic acid 2-glucoside,AA-2G).通过反应条件的优化研究,提高AA-2G的收率.方法:分别考察菌体量、缓冲液pH、蔗糖浓度、维生素C浓度、反应时间和温度对AA-2G合成反应的影响,再组合上述佳条件进行反应.AA-2G的产量使用高效液相色谱法进行定量.结果:佳反应条件为:菌体量15 mg/mL,缓冲液pH 4.5,蔗糖浓度100 g/L,维生素C浓度175 g/L,反应时间20 h,温度37℃.在此条件下,AA-2G产量达到了35.7 g/L.结论:以蔗糖为底物,使用SPase合成AA-2G的研究报道较少.本研究通过优化此方法的反应条件,让AA-2G的产量得到了大幅提高.同时本研究中成功地采用了大肠杆菌工程菌作为全细胞催化剂,这比传统的使用粗酶液的方法更省时省力,有良好的应用潜力.
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α－环糊精葡萄糖基转移酶的高效表达及酶法制备AA－2G条件优化
目的：构建分泌表达α－环糊精葡萄糖基转移酶（α－Cyclodextrin Glycosyltransferase ，α－CGTase）的重组菌株，并利用该酶液制备AA－2G。方法经PCR扩增浸麻芽孢杆菌154基因组获得α－CGTase基因序列，将该基因序列和pET26b载体分别经Nco I、Xho I双酶切后用T4 DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌BL21。利用发酵培养基分泌表达α－CGTase，利用该酶和淀粉糊精、维生素C反应制备AA－2G，并进行制备条件优化。结果在大肠杆菌中实现了α－CGTase的胞外分泌表达，胞外环化酶活力达到120 U／mL，利用该酶的转糖基反应将淀粉糊精、维生素C转化为AA－2G，经HPLC检测正确。结论利用自制α－CGTase得到了AA－2G，通过制备条件优化AA－2G产量为17．46 g／L，转化率达到58．2％（mg／mg）。
关键词： α-环糊精葡萄糖基转移酶 大肠杆菌 维生素C AA-2G 酶法转化
