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猪链球菌2型ABC转运蛋白gene0910敲除突变体的构建及活性分析
目的:构建猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)强毒株05ZYH33 89 K毒力岛上的ABC转运蛋白gene0910敲除突变体,并初步分析其活性,为进一步研究猪链球菌假想毒力因子在致病中的作用提供实验基础.方法:以猪链球菌2型05ZYH33基因组为模板,扩增gene10910两侧各约500 bp左右的片段为上下游同源臂,以psET1质粒为模板,扩增氯霉素抗性基因Cm为中间片段,采用重叠PCR方法搭建三个片段,并克隆到自杀载体pSET4S上,构建基因敲除的载体.电转化05ZYH33感受态细胞,经30℃双交换和40℃质粒丢失,后点板法筛选出基因敲除突变体△0910.对突变株和野生株的生物学活性及小鼠的致病性进行了初步比较.结果:PCR分析和测序结果均显示gcne0910完全被氯霉素抗性基因Cm所替代,基因敲除突变体构建成功.结论:突变株的生物学活性和对小鼠的致病性与野生株相比差异不显著.
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Taqman-MGB双重探针PCR技术检测含89K毒力岛猪链球菌2型
目的 建立同时检测猪链球菌(Streptococcus suis,SS)种特异性16S rRNA及其89K毒力岛基因的SS2中国毒力株双重荧光定量PCR方法 .方法 利用SS种特异性16S rRNA和89K毒力岛基因的特异性序列设计引物和MGB探针.优化荧光定量PCR反应条件和反应体系,并对21株猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)、18株其它链球菌、9株葡萄球菌、5株其它菌株进行检测,验证该方法 的特异性、敏感性、重复性.结果 该技术的种特异性16S rRNA及其89K毒力岛两基因检测灵敏度分别为6个拷贝/反应(或12cfu/mL)及27拷贝/反应(或58cfu/mL);重复性实验,变异系数为0.30%～2.11%;从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右.用该方法 对有关菌株进行考核,21株SS2菌检测结果 均为SS种特异性16S rRNA基因阳性,其中15株含有89K毒力岛的SS2菌株的89K毒力岛基因检测均阳性;而非SS菌株的16S rRNA和89K毒力岛基因检测结果 均为阴性.对49份呼吸道咽拭子、血液应急样本等进行实际考核,有2份血液样本16S rRNA基因阳性,其中1份血液样本89K毒力岛基因阳性.结论 本次建立的TaqMan-MGB双重探针荧光定量PCR方法 特异、快速、敏感,可特异性鉴定SS2中国毒力株(含有89K毒力岛),区分SS与非SS菌以及是否含有89K毒力岛基因,该方法 的建立将有益于目前针对猪链球菌2型中国毒力株快速定量检测,以及疑似猪链球菌病患者病原的早期甄别、猪链暴发疫情调查及猪群暴发或带菌调查与评估等.
关键词： 猪链球菌2型 双重荧光定量PCR MGB探针 16S rDNA基因 89K毒力岛
