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四重PCR反应体系的建立及在牛肉掺假检测中的应用
目的:建立马、牛、猪、鸭肉四重聚合酶链式反应(PCR)反应体系,为牛肉掺假检测提供参考.方法:选取马、牛、猪、鸭肉阳性样本,根据线粒体基因组中细胞色素b(cytochrome b)序列,设计多重PCR引物,同时对马、牛、猪、鸭肉进行PCR及电泳检测,建立四重PCR反应体系,并运用该体系对市场40份牛肉制品进行检测.结果:引物比例为马:牛:猪:鸭=1:1:2:1时,46℃退火温度下反应35个循环,四重PCR效果较好;建立四重PCR反应体系,四重PCR条带清晰且亮度较为一致,几乎没有二聚体产生,扩增灵敏度高.根据样品检测结果,烤牛肉串、牛肉丸的掺假率较高,分别为36.4％、75％,牛排未检出除牛肉外的三种动物源成分,但不排除有其他动物源成分的掺入.结论:四重PCR反应体系可用于牛肉掺假检测.
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四重PCR检测致病性嗜水气单胞菌
目的 建立一种能够快速准确地检测致病性嗜水气单胞菌的四重PCR方法.方法 根据致病性嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶(ahpA)基因、气溶素(aerA)基因和溶血素(hlyA)基因的保守序列以及嗜水气单胞菌的16S rRNA基因种属特异性序列分别设计4对特异性引物,通过优化各引物浓度、退火温度和Mg2+浓度,确定了四重PCR的佳反应条件;然后进行特异性和敏感性试验,并比较其与常规微生物学方法对不同菌株和临床样本的检出率.结果 该方法特异性好,能特异性检测并鉴别出嗜水气单胞菌致病性菌株;检测灵敏度高,低可检测到约100 fg的嗜水气单胞菌基因组DNA;对9株嗜水气单胞菌的检测结果与常规微生物学方法一致,对56份送检的水产动物样品的检出率为21.4%,高于常规微生物学方法的16.1%,两者检测结果符合率为94.6%.结论 成功建立了能同时检测嗜水气单胞菌16S rRNA、aerA、ahpA和hlyA基因的四重PCR方法,能快速、准确地对嗜水气单胞菌进行检测并区分致病性与非致病性菌株.
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真菌四重PCR体系的建立及其临床应用
目的 建立多重PCR体系并探讨其用于深部真菌感染诊断的可行性.方法 用真菌通用引物内转录间区(ITS)联合曲霉属、镰刀菌属、毛孢子菌属、白念珠菌、新生隐球菌特异性引物建立多重PCR体系,用单重和四重PCR检测模拟体液和30例可疑深部真菌感染患者临床标本中的真菌.结果 ITS可与5对属或种特异性引物任意组合(二重PCR),四重PCR组合为ITS+毛孢子菌属+白念珠菌+新生隐球菌.30例临床标本中,真菌培养、PCR检测的阳性率分别为26.67％和43.33％,两种方法的检出率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 单重和四重PCR敏感性高、稳定性好、操作简单、耗时短,可为深部真菌感染的早期诊断提供病原学依据.
