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NGF对神经干细胞内Mash1表达的影响
目的:以Mash1为切入点,深入研究NGF反应性NSCs向胆碱能神经元分化过程中的机制.方法:取体外培养传至第三代的神经干细胞,在含不同浓度NGF的神经干细胞分化培养基中进行分化诱导,采用RT-PCR法测定诱导后Mash1的mRNA相对表达水平.结果:各实验组均有Mash1的表达,其中空白对照组表达少,以NGF 100mg/L组表达量高.结论:NGF能够促进NSCs内Mash1的表达.
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化学合成siRNA对大鼠骨髓间充质干细胞Mash1基因的抑制效应
目的 筛选能有效抑制大鼠骨髓间充质干细胞Mash1基因表达的siRNA序列.方法 根据siRNA靶序列设计原则,设计并化学合成针对大鼠Mash1基因编码区的siRNA三对,并以一对无关序列的寡核苷酸作阴性对照.原代培养大鼠骨髓间充质干细胞并分为5组:Mash1-1组,Mash1-2组,Mash1-3组,无关序列组,空白组.用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000转染,转染后48h行RT-PCR检测Mash1表达水平的变化.结果 转染48h后,与序列3、无关序列、空白组细胞相比,序列1、序列2转染的大鼠骨髓间充质干细胞Mash1 mRNA 水平明显下降.结论 化学合成siRNA能有效地抑制大鼠骨髓间充质干细胞Mash1的表达.
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重组Mash1慢病毒表达载体的构建
目的:克隆小鼠Mash1基因的全长cDNA,构建其慢病毒表达载体Lentivirus-Mash1, 为进一步研究Mash1在神经发育及干细胞神经分化中的作用奠定基础. 方法: 应用RT-PCR从小鼠13 d胚胎中扩增出Mash1 cDNA片段,经回收纯化与pGEM-T载体连接并转化感受态细菌JM109,通过蓝白筛选、PCR扩增和双酶切鉴定出阳性菌落,并对其进行基因测序.BamHⅠ和XholⅠ双酶切pGEM-T-Mash1和Lentivirus获得的目的基因双粘片段与Lentivirus双粘线性质粒相连接,转化JM109,酶切方法鉴定重组阳性菌落.结果:PCR扩增、酶切分析及序列测定证实成功获取Mash1cDNA克隆;酶切鉴定证实Lentivirus-Mash1含有大小正确的正向Mash1cDNA片段.结论:成功建立了小鼠Mash1cDNA克隆并构建了慢病毒表达载体Lentivirus-Mash1.
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神经干细胞定向分化为多巴胺能神经元过程中Mash1及Hes1基因的表达
目的 建立神经干细胞(NSCs)分化为多巴胺能神经元的体外模型,并进一步研究此分化过程中Mash1及Hes1基因的表达变化.方法 无菌条件下取孕14-16d胎鼠端脑进行NSCs体外培养,将NSCs进行Nestin免疫荧光检测,对照组和实验组(GDNF+IL-1α联合组)诱导2周后进行β-tubulinⅢ和TH免疫荧光染色,计算各组阳性细胞率,荧光定量PCR技术检测P4代NSCs分化1周和2周时Mash1及Hes1基因的表达变化.结果 免疫荧光检测结果显示,NSCs的Nestin阳性细胞率为(93.04±3.55)％,诱导分化2周后对照组、实验组β-tubulinⅢ阳性细胞率分别为(12.65±1.58)％和(33.95±2.97)％,两组间比较差异存在统计学意义(P＜0.05).对照组、实验组TH阳性细胞率分别为(1.46±0.41)％、(15.51±1.94)％,差异存在统计学意义(P＜0.05).荧光定量PCR结果显示,NSCs诱导分化后,Mash1基因表达较未分化状态时升高,各组间比较差异存在统计学意义,实验组高于对照组(P＜0.05),分化2周高于1周(P＜0.01);Hes1基因于分化后表达降低,对照组与对实验组之间以及分化1周与2周之间比较差异没有统计学意义(P＞0.05).结论 GDNF和IL-1α联合作用能够诱导NSCs定向分化为多巴胺能神经元;Mash1与Hes1基因可能参与NSCs分化为多巴胺能神经元的过程.
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Mash1在室管膜前下区神经干细胞向神经元分化中的作用
目的研究Mash1在室管膜前下区(SVZa)神经干细胞向神经元分化中的作用.方法体外分离培养新生0 d昆明小鼠的SVZa神经干细胞,原位杂交检测Mash1在SVZa神经干细胞的表达;构建Mash1与绿色荧光蛋白(GFP)正义、反义融合蛋白表达质粒,转染SVZa神经干细胞,GFP活体荧光标记SVZa神经干细胞;采用细胞计数和流式细胞仪检测在Mash1作用下SVZa神经干细胞分化为神经元的比例. 结果体外培养的新生0 d昆明小鼠的SVZa神经干细胞Mash1原位杂交检测阳性;Mash1-GFP+组SVZa神经干细胞分化为神经元的比例明显高于空白对照组;Mash1-GFP-组SVZa神经干细胞分化为神经元的比例明显低于空白对照组.结论体外培养的新生0 d昆明小鼠的SVZa神经干细胞表达Mash1;Mash1可以促进SVZa神经干细胞向神经元方向分化.
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Mash1在室管膜前下区神经干细胞向GABA能神经元分化中的作用
目的 研究Mash1在室管膜前下区(anterior subventricular zone, SVZa)神经干细胞向γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)能神经元分化中的作用.方法 体外分离培养新生0 d昆明小鼠的SVZa神经干细胞,构建Mash1与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)正义、反义融合蛋白表达质粒,转染SVZa神经干细胞,GFP 活体荧光标记SVZa神经干细胞,采用流式细胞仪检测在Mash1作用下SVZa神经干细胞分化为神经元的比例和分化为GABA能神经元的比例.结果 pEGFP-Mash1-质粒、pEGFP-Mash1+质粒双酶切鉴定构建成功,核转染结果表明:GFP融合蛋白表达阳性;pEGFP-Mash1+组SVZa神经干细胞分化为神经元的比例明显高于空白对照组(P＜0.05);pEGFP-Mash1-组SVZa神经干细胞分化为神经元的比例明显低于空白对照组;pEGFP-Mash1+组SVZa神经干细胞分化为GABA能神经元的比例明显高于空白对照组(P＜0.05);pEGFP-Mash1-组SVZa神经干细胞分化为GABA能神经元的比例明显低于空白对照组(P＜0.05).结论 pEGFP-Mash1-质粒、pEGFP-Mash1+质粒构建成功;Mash1可以促进SVZa神经干细胞向神经元方向分化,而且主要表现为促进SVZa神经干细胞向GABA能神经元分化.
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CEPO经Mashl信号促进大鼠局部脑缺血后纹状体内神经发生
为检测氨甲酰化促红细胞叶三成素(CEPO)在大鼠脑缺血后发生过程中的作用及其相关信号通路,本实验将成年大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)后立即尾静脉给予CEPO(50μg/kg).结果显示:CEPO可显著降低大鼠MCAO后3 d梗塞面积,增加缺血侧神经于细胞增殖、促进神经干细胞分化成为神经元.CEPO的促神经发生效应与缺血侧纹状体内前神经元bHLH转录因子Mash1的表达上调密切相关.本结果提示CEPO对脑缺血具有神经保护作用,Mash1信号在缺血侧纹状体内可能介导CEPO增强的神经发生和神经元分化效应.
