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苯并[α]芘对人支气管上皮细胞H19与SAHH表达的影响
[目的]探讨苯并[α]芘(BaP)对人支气管上皮细胞(16HBE)长链非编码RNA(IncRNA)H19和S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)表达的影响,并初步探究H19和SAHH的关系.[方法]用不同浓度(1、2、4、8、16、32.μmol/L)BaP染毒16HBE细胞24h,设置未处理组(仅加培养液)和溶剂对照组;以16 μmol/L BaP染毒16HBE细胞不同时间(1、2、4、8、12、24h),以0h为对照组.用实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测H19的表达水平;通过免疫印迹试验(Western blot)检测SAHH的蛋白表达水平;采用lncRNA原位荧光杂交(FISH)技术结合激光共聚焦显微镜观察H19和SAHH的定位.[结果] RT-PCR结果显示,溶剂对照组与未处理组相比,H19表达差异无统计学意义.随着染毒浓度和时间的增加,16HBE细胞H19表达呈现逐渐升高的趋势.8、16、32μmol/L BaP染毒24h及16 μmol/L BaP染毒4、8、12、24h时,H19表达量分别高于溶剂对照组和0h组(均P＜0.05).BaP染毒浓度为32 μtmol/L时,H19表达量达到峰值,较溶剂对照组增加了78.0％;16μmol/L BaP染毒24h时,H19表达量达到峰值,较0h组增加了48.3％.Western blot结果显示,溶剂对照组与未处理组的SAHH表达差异无统计学意义.随着染毒时间和浓度的增加,16HBE细胞SAHH表达逐渐降低(P＜0.05).BaP浓度为32μmol/L时,SAHH表达降至低,较溶剂对照组降低了37.2％;16μmol/L BaP染毒24h时,SAHH表达降至低,较0h组降低了33.1％.免疫荧光结果显示,H19和SAHH均在细胞质及细胞核中表达,表达主要分布在核周质及核膜;与0h组相比,16 μmol/L BaP染毒细胞24h后H19在核周质处的荧光加强,而SAHH的荧光明显减弱,两者在胞质、胞核中共定位的荧光强度增加.[结论] BaP染毒可引起16HBE细胞H19表达升高而SAHH表达降低;H19与SAHH在细胞内的共定位表达提示两者可能存在相互作用.
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Hcy代谢相关基因甲基化与脑梗死的相关关系
目的 评价Hcy代谢相关基因S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因(AHCY)、胱硫醚β合成酶基因(CBS)甲基化与脑梗死之间有无相关关系.方法 应用荧光定量甲基化特异性PCR(qMSP)检测研究对象外周血中AHCY、CBS基因甲基化水平,并分析其与脑梗死的相关关系.结果 (1)病例组AHCY甲基化水平为0.16％(0.07％,0.32％),对照组为0.25％(0.02％,0.67％),差异无统计学意义(P=0.115,Z=-1.577).(2)病例组CBS甲基化水平70.20％(49.19％,94.87％),对照组为104.10％(74.65％,132.30％),差异有统计学意义(P=3.71E-10,Z=-6.266).按性别、年龄进行亚组分析,CBS基因甲基化水平均低于对照组,且差异具有统计学意义(P<0.05).结论 AHCY基因甲基化与脑梗死发病不相关,而CBS基因低甲基化与脑梗死的发病相关.
关键词： 脑梗死 DNA甲基化 同型半胱氨酸 S-腺苷高半胱氨酸水解酶 胱硫醚β合成酶 -
酵母双杂交技术筛选杜氏盐藻cDNA文库中与S-腺苷高半胱氨酸水解酶相互作用的蛋白
目的:应用酵母双杂交技术筛选杜氏盐藻cDNA文库中能与S-腺苷高半胱氨酸水解酶(dsSAHH)相互作用的蛋白.方法:将构建好的pGBKT7-dsSAHH诱饵载体转化至酵母细胞Y187,与转化有杜氏盐藻cDNA文库的酵母细胞AH109杂交,从杜氏盐藻cDNA文库中筛选出能与dsSAHH相互作用的蛋白质.扩增所得基因片段全长,并在原核内表达该融合蛋白.随后采用Far-western blot、His pull-down及免疫共沉淀方法验证dsSAHH与目的蛋白在体内、外的相互作用.结果:以dsSAHH为诱饵筛选出3个阳性克隆,扩增得到dsRACK1、dsMetAP1和dseEF1α3个新基因.His pull-down和免疫共沉淀体内外实验证实dsRACK1能与dsSAHH相互作用.结论:dsRACK1是dsSAHH的相互作用蛋白.
关键词： S-腺苷高半胱氨酸水解酶 酵母双杂交 蛋白相互作用 免疫共沉淀
