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东方巴贝虫文献资料
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东方巴贝虫cDNA文库的构建与免疫学筛选
目的 构建东方巴贝虫(Babesia orientalis)cDNA文库,从中筛选免疫学阳性的克隆. 方法用东方巴贝虫感染牛,提纯红细胞内虫体的总RNA,反转录合成cDNA,PCR扩增后将其连接于噬菌体载体(λTriplEx2),通过体外包装,建成东方巴贝虫cDNA文库,并进行扩增.用兔抗东方巴贝虫的血清筛选cDNA文库,阳性克隆经大肠埃希菌BM25.8自身环化酶将噬菌体重组子λTriplEx2转化为相应的质粒重组子pTriplEx2,PCR鉴定插入片段大小,并测序,用Blast对测序结果进行同源性分析,并对序列编码的氨基酸序列进行结构和功能的预测. 结果未扩增文库的滴度为2.0×106pfu/ml,重组率为98.8%,文库插入片段大小为500～3 000bp,扩增后的滴度为5.8×108pfu/ml.从东方巴贝虫cDNA文库中筛选得到3个阳性克隆B04、B05和B41,插入片段大小分别约为1 300、1 000和2400bp,3个片段均包含开放阅读框,分别与多种原虫的核动蛋白、功能未知的假定蛋白和热激蛋白70具有较高的同源性.B04、B05和B41分别编码310、192和647个氨基酸,相对分子质量(Mr)别约为34 000、21 000和70 700.结论 构建了较高质量的东方巴贝虫cDNA文库.并发现3个东方巴贝虫阳性克隆.
