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Triapine对肝癌细胞株HepG2中GADD45β表达影响及其可能机制
目的:DNA损伤修复相关基因 GADD45β的特异性表达缺失与肝癌的恶性程度密切相关,本研究初步明确肝癌细胞中GADD45β近端启动子序列,探索3-氨基吡啶-2-甲醛硫代缩氨基脲(Triapine)对人肝癌细胞株HepG2的GADD45β表达影响及其可能机制.方法:体外合成GADD45β近端启动子序列(-618至-314),构建荧光素表达质粒,转染HepG2,根据启动子活性强度结合数据库分析存在的转录调节因子结合位点；以实时荧光定量PCR比较Triapine作用前后HepG2细胞GADD45β表达；进一步比较Triapine对GADD45β启动子活性的调控作用,分析Triapine对HepG2的抑制效应；并通过Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的表达变化测定凋亡的发生和发展.结果:GADD45β近端启动子中含有3个NF-κB (-602/-593、-581/-572、-537/-528)和1个E2F-1 (-470/-436)转录调节因子与启动子结合位点；2.5μmol/L和5μmol/L的Triapine作用后,GA DD45β/GA PDH分别为0.029 3和0.073 9,呈现剂量-诱导效应正相关,同时NF-KB和E2F-1启动子活性分别增强了1.5和0.8倍；高剂量Triapine对HepG2的DNA合成能力和细胞克隆形成能力的抑制率分别为75.25％和60.54％,呈现剂量-抑制效应正相关；Triapine作用后6h即出现HepG2凋亡高峰.结论:Triapine能通过增强转录调节因子的活性,诱导肝癌细胞中特异性缺失的GA DD45β基因表达;进而抑制肝癌细胞的增殖并启动凋亡途径.
关键词： 肝癌 3-氨基吡啶-2-甲醛硫代缩氨基脲 Gadd45β 启动子 -
3-氨基吡啶-2-甲醛硫代缩氨基脲对不同p53状态肝癌细胞中生长抑制及DNA损伤诱导基因45β的诱导差异及其机制
目的 探讨3-氨基吡啶-2-甲醛硫代缩氨基脲(Triapine)对不同p53状态肝癌细胞的生长抑制及DNA损伤诱导基因45β(GADD45β)诱导差异及其调控机制.方法 转染p53全序列建立Hep3B+p53；体外合成GADD45β近端6个启动子序列群(-618 ～-314),构建荧光素表达质粒,转染肝癌细胞株HepG2、Hep3B和Hep3B+p53；以实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)比较Triapine对GADD45β表达诱导及其近端启动子活性影响差异；进一步比较对DNA合成和细胞克隆形成能力抑制差异；并通过半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3的表达变化测定细胞凋亡的发生和发展.结果 Triapine对Hep3B中GADD45诱导并不明显,Hep3B+p53对Triapine敏感性明显增加,2.5、5.0μmol/L剂量下GADD45/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)比值分别为0.0425和0.0704,并呈现出剂量-效应的正相关关系.荧光素分析提示Triapine作用Hep3B+p53后的启动子核因子(NF)-κB(-618/+6)和E2F-1(-470/+6)活性较Hep3B明显增强约1.3倍和0.7倍.Triapine能够更加明显地抑制Hep3B +p53的DNA合成能力和细胞克隆形成能力,5μmol/L Triapine对Hep3B +p53DNA合成的抑制率为40.89％,对细胞克隆形成能力的抑制率达到68.16％,与Hep3B比较差异有统计学意义(P＜0.05).Triapine作用后Hep3B+p53的Caspase-3能迅速激活,活性高峰提前出现于6h.结论 p53在核糖核苷酸还原酶抑制剂化疗药物对肝癌细胞的GADD45诱导中具有重要作用,其作用机制可能是增强转录调节因子的表达水平.
