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双效逆转录载体的构建和受控自杀基因在乳腺癌细胞中表达的研究
目的构建含有Tet-On基因调节系统及自杀基因HSVtk的重组逆病毒载体,研究其在乳腺癌细胞中HSVtk基因的受控表达.方法用PCR方法扩增Tet-On基因,将其插入pRevTRE/HSVtk,形成重组载体pRevTRE/HSVtk/Tet-On.用脂质体介导法将pRevTRE/HSVtk/Tet-On导入乳腺癌细胞株(MCF-7).经过Hygromycin B筛选建立了一株稳定的受四环素衍生物强力霉素(Doxcycline,Dox)调控表达HSVtk基因的乳腺癌细胞株MCF/TRE/HSVtk/Tet-On.用RT-PCR的方法检测不同Dox浓度下HSVtk基因的表达,以MTT法检测不同Dox浓度下Ganciclovir(GCV)对乳腺癌细胞的杀伤作用.结果成功构建了pRevTRE/HSVtk/Tet-On逆病毒载体.筛选出MCF/TRE/HSVtk/Tet-On细胞株,该细胞能在Dox的诱导下表达HSVtk基因并被GCV杀伤.结论HSVtk基因产物可以将无毒性的Ganciclovir(GCV)转变成一种有毒的代谢产物,杀死乳腺癌细胞.而该基因的表达受到Tet-On调控,由强力霉素调节HSVtk基因表达.
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可调控重组腺相关病毒对MCF-7细胞基因转染效率及表达的研究
目的 探讨Tet调控下自杀基因HSVtk重组腺相关病毒载体(rAAV/HSVtk/Tet-On) 对人乳腺癌细胞株(MCF-7)的作用.方法 将HSVtk和Tet-On基因分别定向克隆入腺相关病毒质粒pAAV MCS中, 构建重组腺相关病毒载体pAAV/TRE/HSVtk/Tet-On,与辅助质粒pAAV-RC、pHelper和包装细胞293进行包装、纯化.用β半乳糖苷酶原位染色法检测报告基因rAAV/LacZ在MCF-7中的表达,计算其基因转染效率.采用斑点杂交、RT-PCR检测MCF-7细胞基因组中HSVtk基因整合、病毒滴度及其表达. 结果 rAAV/HSVtk/Tet-On病毒滴度为2.38×1011 particle/ml, LacZ基因在感染的MCF-7中能持续表达,感染效率为20% ～30%.纯化后的重组腺相关病毒感染MCF-7后,能将目的基因转移到靶细胞中,并在Dox诱导下,使GCV对rAAV感染的MCF-7细胞具有明显的杀伤作用. 结论 HSVtk/Tet-On自杀基因调控系统可通过重组腺相关病毒载体成功转染人乳腺癌细胞株MCF-7, 使其HSVtk mRNA表达增加, 在Dox诱导下,GCV对rAAV(≥104v.p/cell)感染的MCF-7细胞具有明显的杀伤作用.
