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家族性高血钾型高血压Cullin3致病突变体neddylation异常的分子机制研究
目的 探讨Cullin3(CUL3)致病突变体Cullin3 △9(缺失9号外显子,CUL3 △9)是否由于与COP9信号体(CSN)结合减弱而导致其类泛素化修饰异常.方法 使用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基培养HEK293细胞株,采用脂质体转染技术,将CSN5 siRNA与FLAG-CUL3质粒或FLAG-CUL3 △9质粒共转染HEK293细胞,Western blotting观察CUL3和CUL3 △9类泛素化修饰程度的变化;转染FLAG-CUL3或FLAG-CUL3 △9质粒后,以金属蛋白酶抑制剂1,10-菲咯啉进行预孵育,Western blotting观察CUL3和CUL3 △9类泛素化修饰程度的变化;在转染FLAG-CUL3质粒和FLAG-CUL3 △9质粒后,以FLAG抗体与Dynabeads Protein G磁珠行免疫共沉淀,Western blotting观察CUL3或CUL3 △9与CSN5的结合状态.结果 转染CSN5 siRNA后,CUL3的类泛素化修饰程度增加,而CUL3 △9的类泛素化修饰程度无明显变化;以1,10-菲罗啉预孵育后,CUL3的类泛素化修饰程度增加,而CUL3 △9的类泛素化修饰程度无明显变化;免疫共沉淀结果显示CUL3与CSN5结合,而CUL3 △9与CSN5结合减弱.结论 CUL3 △9与CSN结合减弱导致类泛素化修饰异常.
关键词： 类泛素化修饰 Cullin3 COP9信号体 家族性高血钾型高血压 -
慢病毒介导的Cullin3沉默对人胶质瘤细胞的影响
目的:探讨慢病毒介导特异性短发夹RNA(shRNA)干扰Cullin3表达对人胶质瘤细胞的影响.方法:RT-qPCR及Western blot检测Cullin3在人胶质瘤细胞系SW1783,U251及U87MG中的表达;构建靶向Cullin3的shRNA重组慢病毒,转染U251和U87MG细胞并测定转染效率.实验分为3组:Blank组(阴性对照组)、NC-shRNA组(空载慢病毒组)及Cullin3-shRNA组(慢病毒介导Cullin组).MTT法和BrdU实验检测细胞活力和增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移能力;流式细胞术检测细胞周期的变化.结果:与正常人星形胶质细胞相比,Cullin3在人胶质瘤细胞系SW1783,U251及U87MG中高表达.Cullin3-shRNA转染U251和U87MG细胞后,与Blank组及NC-shRNA组相比,Cullin3-shRNA组Cullin3表达水平下降(P＜0.05),细胞活力和细胞增殖能力显著降低,侵袭能力下降,细胞周期被阻滞于G0/G1期.结论:Cullin3在胶质瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用,提示Cullin3有望成为人脑胶质瘤基因治疗的候选靶点.
