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利用微生物气溶胶发生器评估较低压差状态下独立通风笼盒(IVC)内微生物污染情况
目的 利用微生物气溶胶发生器制造微生物感染环境,评估在低压差条件下独立通风笼盒(IVC)内微生物的污染情况.方法 IVC压差分别设定为3 Pa和10 Pa,放置于负压屏障环境内.分别在笼架外四角、中间的笼盒盖上以及对应的笼盒内放置培养皿,细菌培养皿为血平皿,病毒培养皿为内置直径2 cm吸附滤纸的玻璃平皿.将微生物气溶胶发生器放置于距离笼架 2 m处,间隔48 h分别雾化5 ml的1.9×108个/ml的金黄色葡萄球菌和2.4×10-4 TCID50的小鼠脑脊髓炎病毒,雾化停止后30 min、60 min,用培养法及荧光定量PCR法检测预先放置的平皿内病原.结果 大、小鼠IVC在设定为10 Pa及3 Pa时,实际测定压差分别为2.2 Pa和7.8 Pa,经培养法及荧光定量PCR法检测,金黄色葡萄球菌培养数量在30 min检测低值为222个/平皿,60 min检测均大于500个/平皿,而放置于笼盒内的平皿未见生长;小鼠脑脊髓炎病毒拷贝数在30 min检测低为1.23×102,60 min低为1.61 × 104,而放置于笼盒内的平皿未能检出.结论 IVC笼盒在小压差为2.2 Pa时也能够防止外来病原的进入.
关键词： 独立通风笼盒(IVC) 梯度压差 气溶胶发生器 金黄色葡萄球菌 小鼠脑脊髓炎病毒 -
小鼠脑脊髓炎病毒非编码蛋白片段实时荧光定量PCR标准品的构建
目的 构建小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)非编码蛋白(UTR)片段标准品,用于实时荧光定量 PCR检测小鼠脑脊髓炎病毒.方法 RT-PCR 扩增TMEV UTR片段上80~1094 nt之间长度为1 014 bp的片段,将目的 片段连接至pMD18-T载体,转化至DH5a感受态细胞.分别经 PCR鉴定和序列测定验证重组质粒.分光光度计测量重组质粒的吸光值,换算成拷贝数浓度后作10倍梯度稀释制得质粒标准品.然后进行实时荧光定量PCR分析,绘制标准曲线.结果 TMEV UTR片段成功克隆至pMD18-T载体中,测序结果 表明重组质粒中插入的UTR序列正确,实时荧光定量PCR分析10倍梯度系列稀释的质粒标准品所得到的标准曲线良好,统计学分析显示Ct值与标准品浓度的对数存在良好线性关系,回归系数在0.99以上.结论 成功构建了TMEV UTR 片段实时荧光定量PCR标准品,为今后TMEV实时荧光定量PCR检测打下了基础.
