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H5N1亚型禽流感病毒聚合酶酸性蛋白真核表达载体的构建与表达
目的 构建甲型禽流感病毒H5N1亚型聚合酶酸性蛋白(PA)的真核表达载体,并表达其编码蛋白PA.方法 采用RT-PCR法扩增PA基因,克隆至pMD18-T载体中构pMD18-T-PA质粒.双酶切pMD18-T-PA质粒与pXJ40-HA质粒后,胶回收并连接目的片段,构建真核表达载体pXJ40-HA-PA,鉴定后转染293T细胞.采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组PA蛋白的表达.结果 成功构建了禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,并在真核细胞中成功表达出分子量为75kD的重组蛋白.结论 成功构建禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,为后期进一步研究PA蛋白的功能奠定了基础.
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2006年人禽流感H5N1毒株PA基因特性、变异和进化
目的 通过对人禽流感H5N1毒株PA基因序列的变异分析,揭示毒株PA基因特征、变异与进化.方法 检测广东地区人禽流感H5N1毒株PA基因核苷酸序列,同时检索全球人禽流感H5N1毒株PA基因序列,采用MEGA 4.0软件对检索的人禽流感H5N1毒株PA基因核苷酸序列进行比对和分析;并结合流行病学资料对变异毒株进行进化速度分析.结果 PA蛋白呈酸性,等电点pH 5.4.1997-2006年52株毒株PA基因核苷酸序列同源性分成两组,1997年毒株为第一组(G1),2003-2006年香港、越南、泰国、印尼、中国大陆毒株、土耳其、伊拉克、阿塞拜疆、埃及毒株为第二组(G2).PA基因114个氨基酸位点置换,占15.9%(114/716),其中2003-2006年毒株PA基因有17个氨基酸位点不同于1997年毒株.PA基因Ks值为30.9×10-6～46.1×10-6 Nt/d,Ka值为4.50×10-6～8.13×10-6 Nt/d;而PA基因的同义突变速度是错义突变速度的5.7～6.9倍,显示PA基因受到机体免疫压力较小;检验发现PA基因进化存在负选择性压力.PA基因中潜在的7个糖基化位点基本稳定,毒株IDNS-569H-06的PA基因半胱氨酸发生置换(S224C).结论 PA基因进化分成两系列,PA基因进化特点是自发突变较快,而受到机体免疫机制压力较小;A基因与其它多聚酶基因(PB2和PB1)比较,核苷酸序列同源性和进化在时间特征和地区特征方面具有一致性;来自中国大陆的毒株进化值得关注.人禽流感H5N1毒株PA基因在自然界变异频繁,可能影响H5N1毒株致病性和在人-人传播能力.
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RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制
目的:应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对流感病毒NP或/和PA基因的siRNA抑制NP或/和PA基因的表达及抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖. 方法: 分别构建针对NP,PA及同时干扰NP和PA的三种siRNA表达质粒pEGFP/NP,pGenesil/PA和pEGFP/NP+PA,转染MDCK后,H5N1亚型流感病毒感染细胞,荧光显微镜判断转染效率,蛋白质印迹和半定量RT-PCR检测NP及PA蛋白表达及基因转录水平的变化,并在不同时间点检测细胞培养上清中的血凝值(HA),观察siRNA抑制流感病毒增殖的能力. 结果: 荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达65.0%. 蛋白质印迹结果表明,重组质粒pEGFP/NP和pEGFP/NP+PA均能抑制NP蛋白在MDCK细胞内的表达,两者的抑制率分别为64.5%和69.6%. 半定量RT-PCR检测到pEGFP/NP质粒在MDCK细胞内对NP基因的转录抑制率为66.0%;pGenesil/PA质粒对PA基因的转录抑制率为63.0%;pEGFP/NP+PA质粒对NP和PA基因的转录同时抑制率,分别为71.4%和69.3%. 而对照质粒pEGFP/HK对NP或/和PA基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用. HA结果表明,三种质粒均能抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖,以pEGFP6/NP+PA的作用为显著,它们抑制流感病毒增殖的能力分别为87.0%,75.0%和96.9%. 结论: NP或/和PA基因的siRNA质粒可明显抑制NP或/和PA基因的转录和表达,并有效地抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.
