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转录激活因子3通过调控活化T细胞核因子1介导足细胞损伤
目的:探讨辅助转录因子——转录激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)调控活化T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)在足细胞损伤中的作用. 方法:(1)通过免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜,观察ATF3在不同肾小球疾病患者足细胞中的表达,并通过Western印迹验证不同肾小球疾病患者肾组织ATF3的表达情况;(2)体外培养小鼠永生化足细胞,用脂多糖(LPS) 100 μg/ml和ionomycin 2 μmol/L分别刺激足细胞0h、1h、2h、4h、6h后,采用实时荧光定量PCR (RT-PCR)和Western印迹检测ATF3 mRNA和蛋白的表达;(3)足细胞转染ATF3 siRNA后,通过Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡情况,RT-PCR和Western印迹检测凋亡相关标记物BAX、Bcl-2的表达,Western印迹检测足细胞标记蛋白podocin的表达;(4)通过Western印迹、免疫荧光染色、激光共聚焦观察在LPS和Ionomycin刺激下细胞核内ATF3表达情况;(5)通过免疫染色质共沉淀(ChIP)实验观察ATF3与核转录因子NFATc1启动子之间的关系,并通过RT-PCR和Western印迹检测足细胞沉默ATF3后对NFATc1的mRNA及蛋白表达的影响. 结果:(1)与正常肾组织相比,肾小球疾病患者肾组织足细胞ATF3表达明显增多;(2)用LPS和Ionomycin刺激足细胞,2h后ATF3的表达增高明显,随后降低,到6h基本恢复正常;(3)沉默ATF3基因后,细胞凋亡率减少,凋亡相关标记物BAX下调,Bcl-2上调,并部分逆转足细胞标记蛋白podocin的下调;(4)在损伤刺激后,细胞核内ATF3表达增多;(5)ChIP实验显示ATF3与核转录因子NFATc1的启动子区域有结合,在Ionomycin刺激后,结合量明显增加,且沉默ATF3基因后,NFATc1表达减少. 结论:辅助转录因子ATF3参与NFATc1介导的足细胞损伤,即通过结合NFATc1启动子,增强NFATc1表达,促进足细胞损伤.
