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肝细胞癌中与转录激活因子3相互结合的蛋白质的筛选及验证
目的 筛选及验证肝癌细胞中与转录激活因子3(ATF3)相互结合的蛋白质,初步探讨在肝癌发生发展中协助ATF3发挥生物学功能的相关分子机制.方法 应用免疫沉淀法沉淀出HepG2细胞中与ATF3相互结合的蛋白,经变性聚丙烯凝胶分析,与空载体组比对,挑选出差异性的电泳条带进行蛋白质谱分析,筛选出候选蛋白;再经免疫共沉淀验证二者是否相互结合;应用免疫组织化学及Western blot检测并分析ATF3和候选蛋白在肝癌中的表达模式.结果 过表达ATF3的HepG2实验组呈现出差异性表达的电泳条带;经质谱检测,Mascot软件分析及NCBI数据库检索,得到候选蛋白肽段信息,结合前期实验结果,PubMed文献报道,从中筛选出与ATF3可能相关的蛋白gelsolin(GSN);免疫共沉淀结果验证了ATF3与GSN相互结合的关系,免疫组织化学及Western blot检测出肝癌组织中ATF3与GSN的表达模式一致.结论 ATF3可能通过与GSN蛋白之间的相互作用,在肝癌形成过程中协同发挥抑癌作用.
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微小RNA-106b参与内皮细胞介导的血管新生作用机制研究
目的：研究微小RNA（microRNA ，miR）-106b是否参与动脉粥样硬化相关的血管新生，明确miR-106b在内皮细胞中参与血管新生的作用机制。方法内皮细胞培养并转染miR-106b ，分为miR-106b组、空白对照组和阴性对照组。提取RNA、反转录及实时定量PCR检测miR-106b相对表达量以明确转染效率。观察各组内皮细胞在凝固的基质胶中管腔形成情况。TUNEL法检测转染后细胞凋亡状况并进行靶基因的预测，采用Western blot法检测筛选的蛋白相对表达量变化。结果与空白对照组和阴性对照比较，miR-106b组在基质胶中管腔形成明显减少；与阴性对照组比较，miR-106b组管腔比值、信号转导及转录激活因子3 mRNA相对表达量及蛋白表达明显降低（P＜0．05，P＜0．01）。阴性对照组与miR-106b组细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（1．19％ vs 3．39％，P＞0．05）。结论 miR-106b在内皮细胞抑制血管新生可能是通过下调信号转导及转录激活因子3，与血管内皮生长因子无直接关系。
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转录激活因子3对绿脓杆菌致急性肺损伤小鼠肺泡灌洗液炎症因子的影响
目的 探讨转录激活因子3(ATF3)对绿脓杆菌致急性肺损伤(ALI)小鼠肺泡灌洗液炎症因子的影响.方法 以荧光标记的绿脓杆菌(PA)(1.5× 108 CFU/ml,50 μl)经鼻滴入C57BL/6野生型和ATF3敲基因小鼠气管构建急性肺损伤模型;ELISA检测WT小鼠和ATF3-KO小鼠肺泡灌洗液中前炎症因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度.结果 经鼻滴入绿脓杆菌6h后小鼠肺组织病理检测表现为:中性粒细胞大量浸润、肺泡结构破坏、肺泡出血以及肺间质水肿,证实成功构建了经鼻滴入绿脓杆菌(PA)诱导的急性肺损伤模型.野生型小鼠在绿脓杆菌滴入后肺泡灌洗液中IL-1β的浓度于3、6、12和24 h时分别为(198.36±20.85) pg/ml,(131.93±8.23) pg/ml,(130.10±15.65) pg/ml,(67.04±2.77) pg/ml;肺泡灌洗液中IL-6的浓度于3、6、12和24 h时分别为(1 657.59±77.13) pg/ml,(1 232.78±31.85) pg/ml,(103.33±1.75) pg/ml,(24.44±5.79) pg/ml;肺泡灌洗液中TNF-α的浓度于3h,6h,12h和24 h时分别为(542.12±49.12) pg/ml,(347.89±34.38) pg/ml,(42.23±9.63)pg/ml,(19.45±3.23) pg/ml.野生型小鼠急性肺损伤小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α浓度均于3h表达高,故选择3h时相点对敲基因小鼠进行检测,ATF3敲基因小鼠在绿脓杆菌滴入后3h时肺泡灌洗液中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度分别为(321.25±7.81) pg/ml、(2 479.69±127.4) pg/ml、(840.75±22.97) pg/ml,表达明显高于野生型小鼠急性肺损伤组及对照组,均存在显著差异(P＜0.05).结论 ATF3对绿脓杆菌致急性肺损伤小鼠的炎症反应有抑制作用.
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转录因子E2F3对浸润性膀胱癌细胞因子的调控反应
目的 E2F3在浸润性膀胱癌的发生、发展中起着重要作用,但是其具体调控分子机制尚不明确,本研究旨在探讨E2F3对浸润性膀胱癌细胞调控的分子机制.方法 采用RNAi技术使E2F3在浸润性膀胱癌细胞系中低表达,通过蛋白质印迹法、PCR进行检测及后续实验,通过CHIP实验等观察E2F3在HT1376和TCCSUP细胞系中与信号转导及转录激活因子3(STAT3)和Etsl之间及其相关侵袭细胞因子的调节关系.结果 E2F3、STAT3和Etsl基因在高表达E2F3细胞系(HT1376和TCCSUP)中成功被沉默,CHIP测序显示,E2F3与Etsl和STAT3基因启动子结合增多只出现在过表达膀胱癌细胞系中;免疫组化和蛋白质印迹法检测结果显示,E2F3过表达细胞癌中,Etsl和STAT3基因过表达,二者呈正相关,r=0.421,P=0.023;E2F3高表达同时相关细胞因子也增加(IL-1、IL-8、TNF-α和VEGFA等),Etsl和STAT3被沉默后,上述细胞因子也相对降低,CHIP实验显示,与低表达E2F3膀胱癌相比,在高表达E2F3膀胱癌中,Etsl和STAT3启动子活性增强.结论 E2F3过表达在人膀胱癌细胞系中通过Etsl和STAT3调节免疫相关基因的表达,E2F3的过表达促进Etsl和STAT3的表达.
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Ether à go-go 1在人骨肉瘤细胞和组织中的表达及其调控骨肉瘤恶性表型的分子机制
目的：探讨Ether à go-go 1（ Eag1）在人骨肉瘤细胞和组织中的表达及其调控骨肉瘤恶性表型的分子机制。方法采用逆转录-聚合酶链反应（ RT-PCR）、Western blot和免疫组化检测骨肉瘤细胞和组织中Eag1的表达。采用小干扰RNA （siRNA）抑制Eag1的表达，并采用CCK-8法、克隆形成实验、Transwell体外侵袭实验和划痕实验检测Eag1 siRNA转染后骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力的变化。建立裸鼠骨肉瘤异种移植模型，绘制肿瘤生长曲线，Western blot检测骨肉瘤细胞中血管内皮生长因子（VEGF）和信号转导和转录激活因子3（STAT3）的表达水平。结果 Eag1在MG-63、Saos -2细胞及骨肉瘤组织中异常高表达。 CCK-8法检测显示，MG-63和Saos-2细胞中，对照组、Eag1 siRNA1组和Eag1 siRNA2组的细胞存活率分别为（100．00±4．65）％、（63．57±3．89）％、（54．13±3．70）％和（100．00±5．46）％、（56．70±5．34）％、（40．27±5．28）％，与对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0．001）。克隆形成实验显示，MG-63和Saos-2细胞中，对照组、Eag1 siRNA1组和Eag1 siRNA2组的克隆形成率分别为（92．00±3．46）％、（60．00±3．06）％、（53．67±2．40）％和（92．00±5．57）％、（52．33±5．13）％、（41．67±2．73）％，与对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0．001）。裸鼠骨肉瘤生长结果显示，从治疗后第10天起，Eag1 siRNA1组和Eag1 siRNA2组裸鼠的骨肉瘤体积小于对照组，差异有统计学意义（均P＜0．01）。侵袭实验显示，MG-63和Saos-2细胞中，对照组、Eag1 siRNA1组和Eag1 siRNA2组的侵袭细胞数分别为（134．00±3．61）个、（105．20±2．52）个、（91．00±3．01）个和（132．30±3．23）个、（114．30±3．48）个、（82．67±6．33）个，与对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0．01）。划痕实验显示，MG-63和Saos-2细胞中，对照组、Eag1 siRNA1组和Eag1 siRNA2组的细胞迁移率分别为（62．48±1．83）％、（35．98±1．23）％、（32．30±1．20）％和（70．15±1．42）％、（41．38±1．34）％、（32．40±1．92）％，与对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0．001）。沉默Eag1基因可明显下调骨肉瘤中VEGF及STAT3蛋白的表达。结论 Eag1可能通过调控STAT3-VEGF信号通路参与骨肉瘤细胞的增殖和侵袭过程，可作为骨肉瘤潜在的治疗靶点。
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人脑胶质瘤转录激活因子3、maspin和基质金属蛋白酶2蛋白表达及意义
目的 探讨人脑胶质瘤中转录激活因子3(ATF3)、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制因子(maspin)和基质金属蛋白酶2(MMP2)的蛋白表达情况及其与胶质瘤发展的相关性.方法 采用免疫组织化学染色法、Western blot法检测100例脑胶质瘤患者和13例健康脑组织中ATF3、maspin和MMP2的蛋白表达相对量.结果 ATF3在胶质瘤中的表达(72.0%)明显高于健康脑组织(15.4%)(P<0.05),MMP2在胶质瘤中的表达(76.0%)明显高于健康脑组织(7.7%)(P<0.05),maspin在胶质瘤中的表达(53.0%)明显低于健康脑组织(100.0%)(P<0.05).随胶质瘤病理级别的增高,ATF3和MMP2的表达量逐级增高,而maspin表达量逐级递减.ATF3蛋白表达与maspin蛋白表达呈负相关(r=-0.457,P<0.01),ATF3蛋白表达与MMP2蛋白表达呈正相关(r=0.553,P<0.01),maspin蛋白表达与MMP2蛋白表达呈负相关(r=-0.551,P<0.01).结论 ATF3、maspin和MMP2三者间的表达有相关性,ATF3、MMP2高表达及maspin低表达与胶质瘤的发生密切相关,它们可能在胶质瘤发生发展、侵袭转移过程中发挥重要作用.
关键词： 转录激活因子3 乳腺丝氨酸蛋白酶抑制因子 基质金属蛋白酶2 胶质瘤 -
稳定表达siRNA-STAT3基因Hep-2细胞系的建立
目的 建立稳定表达siRNA-STAT3基因的Hep-2细胞系,为进一步探讨STAT3在喉癌中的作用机制提供基础.方法 产生针对STAT3的小发卡状RNA寡核苷酸,连接到PGPU6/GFP/Neo载体,双酶切和质粒测序鉴定真核表达质粒PGPU6/GFP,Neo-siRNA-STAT3,G418筛选稳定转染细胞系,蛋白印迹法测定P-STAT3的表达.分别用MTT法绘制生长曲线和平板克隆形成实验测定单细胞增殖能力.结果 构建了重组干扰质粒并筛选出了阳性克隆,蛋白印迹法鉴定STAT3被抑制后P-STAT3表达也明显下降.生长曲线显示siRNA-STAT3组3天后抑制效应才较为明显(P=0.001),5 d后抑制效应更加突出(P=0.000),其抑制效应呈时间-效应关系.另外,siRNA-STAT3组单克隆形成率也明显低于对照组(P=0.000).结论 本研究筛选了可稳定、较高水平表达siRNA-STAT3的Hep-2细胞系.干扰STAT3表达对细胞增殖抑制的作用较为明显.
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STAT3 siRNA引起U251细胞凋亡的研究
目的:观察利用siRNA技术下调人脑胶质母细胞瘤细胞(U251)STAT3表达后对细胞凋亡的影响. 方法:分离培养并间接免疫荧光鉴定大鼠原代星形胶质细胞(NA),用STAT3干涉质粒载体(pSilence2.1-STAT3)及对照载体(pSilence2.1-GFP)转染U251细胞及NA细胞,用Hoechst 33258染色观察凋亡的形态学改变,用Annexin-V试剂盒定量检测凋亡.结果:分离培养了符合实验要求的NA细胞,转染pSilence2.1-STAT3后,U251细胞出现了明显的时间依赖性细胞凋亡,而NA细胞无显著凋亡发生.结论:pSilence2.1-STAT3能诱导U251细胞凋亡,而对正常细胞无显著影响.
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STAT3 RNAi联合γ射线照射对U251细胞增殖的影响
目的 构建特异性抑制信号转导与转录激活因子3(STAT3)的小干扰RNA(siRNA)表达载体并检测联合60Co γ射线照射对U251细胞STAT3表达及细胞增殖的抑制作用.方法 设计、合成STAT3特异性的19 bp短链寡核苷酸,经退火形成双链DNA片段,克隆到pSilence2.1-U6-H1载体中,构建STAT3特异siRNA的表达载体,Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切及测序鉴定重组体,并转染U251细胞,免疫印迹法(Western blot)检测STAT3 mRNA和蛋白的表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖活性,克隆形成率及MTT实验确定放疗剂量.结果 经双酶切与测序鉴定成功构建pSilence2.1-STAT3表达载体,转染星形胶质瘤细胞株U251细胞可显著抑制细胞中STAT3蛋白的表达水平;确定2 Gy为放疗剂量.转染pSilence2.1-STAT3,细胞增殖活性较未转染U251细胞显著降低(P＜0.05),联合60Co γ射线照射U251细胞增殖活性单独转染进一步显著降低(P＜0.05).结论 运用pSilence2.1-U6-H1载体构建的pSilence2.1-STAT3表达载体可有效抑制STAT3的表达及星形胶质瘤细胞的增殖;联合2 Gy 60Co γ射线照射可增加抑制效果.
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ATF3在心血管系统中的研究进展
转录激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)是一种应激快反应基因,属于ATF/CREB家族成员,在大部分细胞中能够稳定表达.ATF3广泛参与机体内各种生理病理过程,如调节细胞周期、影响凋亡、抑制炎性因子表达等,其活性异常甚至与多种肿瘤的形成密切相关.近年研究发现,ATF3与多种心血管疾病的发生、发展有关,已成为心血管疾病的研究热点之一.
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沉默信息调节因子1在胃癌发展中的作用机制研究
目的：探讨沉默信息调节因子1(SIRT1)在胃癌发展中的可能分子机制和信号通路。方法：人胃癌细胞株HGC-27分为转染shRNA-SIRT1组及对照组,应用实时定量PCR及免疫印迹法检测转录激活因子3(STAT3)在两组中的表达；免疫共沉淀法分析SIRT1同STAT3、磷酸化STAT3在胃癌中的相互作用关系；建立STAT3敲除转基因小鼠胃癌模型,免疫组织化学方法检测STAT3敲除转基因小鼠胃癌组织中SIRT1的表达情况。结果： STAT3mRNA在shRNA-SIRT1组和对照组中表达无明显区别,免疫印迹检测发现STAT3蛋白水平在胃癌细胞组和空转组中较shRNA组中表达增高,磷酸化P-STAT3与STAT3表达水平相同,而乙酰化A-STAT3的表达水平正好相反。免疫共沉淀发现SIRT1同STAT3和PSTAT3能形成复合物。应用STAT3敲除转基因小鼠胃癌模型,进行SIRT1表达的对比研究,发现SIRT1在STAT3敲除转基因小鼠胃癌组织中的表达较对照组降低。结论：通过研究SIRT1同STAT3在胃癌中的相互作用关系,推测SIRT1可能通过对STAT3的去乙酰化作用,间接增强活化的磷酸化 STAT3,并形成 SIRT1-STAT3复合物,促进胃癌的发展。SIRT1可能通过JAK1-STAT3途径或直接激活STAT3参与胃癌的进展过程。
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右美托咪定对小鼠内毒素性急性肺损伤时JAK2/STAT3信号通路的影响
目的 评价右美托咪定对小鼠内毒索性急性肺损伤时蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)/信号转导和转录激活因子3(STAT3)信号通路的影响.方法 清洁级健康雄性成年C57BL/6小鼠24只,体重20～25 g.采用随机数字表法分为3组(n=8):对照组(C组)、内毒素性急性肺损伤组(ALI组)和右美托咪定组(Dex组).采用腹腔注射脂多糖(LPS)5 mg/kg的方法制备小鼠内毒素性急性肺损伤模型.Dex组于注射LPS后1h时腹腔注射右美托咪定40 μg/kg,C组和ALI组给予等容量生理盐水.腹腔注射LPS后6h,采集颈动脉血样测定PaO2,随后处死动物,收集支气管肺泡灌洗液(BALF),测定BALF总蛋白、IL-1β、IL-6及TNF-α的浓度;取肺组织称重,计算肺湿重/干重(W/D)比值,检测磷酸化JAK2(p-JAK2)及磷酸化STAT3(p-STAT3)、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA和TNF-α mRNA的表达,观察病理学结果并进行肺损伤评分.结果 与C组比较,ALI组和Dex组PaO2降低、肺W/D比值、肺损伤评分、BALF总蛋白、IL-1β、IL-6及TNF-α、肺组织IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA、p-JAK2和p-STAT3表达水平升高(P＜0.05);与ALI组比较,Dex组PaO2升高、肺W/D比值、肺损伤评分、BALF总蛋白、IL-1β、IL-6及TNF-α、肺组织IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA、p-JAK2和p-STAT3表达水平降低(P＜0.05).结论 右美托咪定减轻小鼠内毒素性急性肺损伤的机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路激活有关.
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α7nAChR在电针减轻大鼠内毒素性急性肺损伤中的作用:与JAK2/STAT3信号通路的关系
目的 评价α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)在电针减轻大鼠内毒索性急性肺损伤(ALI)中的作用及其与Janus激酶2信号转导和转录激活因子3(JAK2/STAT3)信号通路的关系.方法 清洁级健康雄性SD大鼠60只,体重200～220 g,8周龄,采用随机数字表法分为6组(n=10):对照组(C组)、ALI组、电针+ALI组(EA组)、α7nAChR拮抗剂α-银环蛇毒素(α-BGT)+ALI组(BA组)、电针+α-BGT+ ALI组(EBA组)和非经非穴+ALI组(SEA组).采用静脉注射脂多糖(LPS)5 mg/kg的方法制备大鼠内毒素性ALI模型.EA组和EAB组于模型制备前1～4d(刺激时间9:00至10:00,30 min/次,1次/d)及模型制备过程中电针刺激双侧足三里及内关穴(刺激强度以大鼠肢体出现微颤为宜,疏密波频率2/15 Hz,波宽0.2～0.5 ms,电流强度1～2 mA.SEA组以相同电针参数刺激足三里穴及内关穴旁开0.5 cm非经非穴处.于模型制备前30 min BA组和EBA组腹腔注射α-BGT 1 μg/kg.给予LPS后6h时处死大鼠取肺组织,观察病理学结果并行肺损伤评分,确定肺湿/干重(W/D)比值,采用ELISA法确定肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量,Western blot法检测α7nAChR、磷酸化JAK2(p-JAK2)及磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达水平.结果 与C组比较,余5组肺损伤评分、W/D比值和肺组织TNF-o、IL-1β、IL-6含量升高,α7nAChR、p-JAK2及p-STAT3表达上调(P＜0.05);与ALI组比较,EA组肺损伤评分、W/D比值和肺组织TNF-α、IL-1β及IL-6含量降低,α7nAChR、p-JAK2及p-STAT3表达上调,BA组肺损伤评分、W/D比值和肺组织TNF-α、IL-1β及IL-6含量升高,α7nAChR、p-JAK2及p-STAT3表达下调(p＜0.05),SEA组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05);与EA组比较,EBA组肺损伤评分、W/D比值和肺组织TNF-α、IL-1β及IL-6含量升高,α7nAChR、p-JAK2及p-STAT3表达下调(P＜0.05).结论 α7nAChR表达上调激活JAK2/STAT3信号通路参与了电针减轻大鼠内毒素性ALI的过程.
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蓝莓联合益生菌通过IL-22调控的JAK1/STAT3/BAX通路改善非酒精性脂肪性肝病的作用机制
目的 研究蓝莓联合益生菌通过对IL-22调控的JAK1/STAT3/BAX信号通路的影响,进一步探明其改善非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的作用机制.方法 清洁级SD大鼠40只分为正常对照组(CG)、IL-22siRNA阴性对照组(IL-22SI-NC)、IL-22siRNA组(IL-22SI)、IL-22siRNA阴性对照+蓝莓益生菌组(IL-22SI-NC+ BPG)、IL-22siRNA+蓝莓益生菌组(IL-22SI+BPG).正常对照组予100％普通饮食,其余大鼠均采用复合高脂饲料制备脂肪肝模型,同时予IL-22siRNA阴性对照慢病毒及IL-22siRNA慢病毒腹部肝区注射(盲穿),隔日1次,共12周,取肝脏确认造模及siRNA封闭效果后予蓝莓益生菌原液灌胃,同时按上述分组后给予正常饮食,予蓝莓益生菌原液灌胃,共观察8周.多组间比较采用单因素方差分析,进一步比较方差齐时采用SNK法(g检验),方差不齐时用Tamhane法(q'检验).结果 IL-22SI组与IL-22SI-NC组比较,ALT、AST、TC、TG、LDL均显著升高(P值均＜0.01),HDL显著降低(P＜0.01),IL-22、JAK1、STAT3的mRNA及蛋白表达均明显减弱(P值均＜0.01)、BAX的表达明显升高(P＜0.01);与IL-22SI-NC相比,IL-22SI-NC+ BPG的ALT、AST、TC、TG、LDL均明显降低(P值均＜0.01),HDL明显升高(P＜0.01),IL-22、JAKI、STAT3的mRNA及蛋白表达均显著升高(P值均＜0.01),BAX的表达显著下降(P ＜0.01);IL-22SI+ BPG较IL-22SI组ALT、AST、TC、TG、LDL均略有降低(P值均＜0.05),HDL略有升高(P＜0.05),IL-22、JAK1、STAT3的mRNA及蛋白表达均有所增加(P值均＜0.05),BAX的表达略有减少(P＜0.05).结论 蓝莓联合益生菌能一定程度拮抗IL-22siRNA所加剧的肝细胞脂肪变性,并可以增强IL-22的表达,提示IL-22可能为蓝莓联合益生菌影响NAFLD的关键作用因子.推测蓝莓联合益生菌能增强IL-22表达,激活JAK1/STAT3信号通路,抑制其下游凋亡因子BAX的表达,减少肝细胞凋亡,增强胆固醇代谢,减少脂质沉积,达到改善NAFLD的目的,是NAFLD的一个辅助治疗方案.
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葛根素对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏瘦素受体mRNA和磷酸化Janus激酶2/磷酸化信号转导与转录激活因子3的影响
目的:观察葛根素对非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)大鼠血清瘦素、肝组织瘦素受体mRNA和磷酸化Janus激酶2(phosphorylated Janus kinase 2,P-JAK2)/4酸化信号转导与转录激活因子3(phosphorylated signal transducers and activators of transcription factor 3,P-STAT3)蛋白表达的影响.方法:高脂饲料制备SD雄性大鼠NAFLD模型,随机分为空白组和造模组.待造模成功后,将造模组大鼠随机分为模型组、辛伐他汀组和葛根素组.治疗4周后行肝组织生化和病理学检测,并同时应用酶联免疫吸附检测试剂盒检测血清瘦素,实时逆转录聚合酶链反应法检测肝组织瘦素受体mRNA表达,应用Western免疫印迹法检测肝组织P-JAK2/P-STAT3蛋白的表达.结果:葛根素能明显降低NAFLD大鼠甘油三酯和总胆固醇水平,改善脂肪变性,降低肝脏炎症反应,并能明显降低血清瘦素高水平状态,同时增加瘦素受体mRNA的表达,增加肝组织P-JAK2/P-STAT3蛋白的含量.结论:葛根素可通过改善瘦素抵抗,增加肝脏瘦素受体mRNA表达及P-JAK2/P-STAT3蛋白含量而实现对NAFLD大鼠肝脏脂质和炎症的治疗作用.
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STAT3特异性小干扰RNA表达载体的构建及其对STAT3表达的抑制
目的构建特异性抑制信号转导与转录激活因子3(STAT3)的小干扰RNA(siRNA)表达载体并检测其对STAT3表达及PC-3细胞增殖的抑制作用.方法设计、合成STAT3特异性的短链寡核苷酸,经退火形成双链DNA片段,克隆到pSilen-cerTM2.1-U6载体中,构建STAT3特异siRNA的表达载体,Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切及测序鉴定重组体,并转染PC-3细胞,G418筛选出稳定表达细胞株,半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法和免疫印迹法检测STAT3 mRNA和蛋白的表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖活性.结果经双酶切与测序鉴定成功构建STAT3-siRNA表达载体,转染前列腺癌细胞株PC-3可显著抑制细胞中STAT3 mRNA和蛋白的表达水平(抑制率分别为52.4%及50.5%),且细胞增殖活性亦较未转染PC-3细胞显著降低(p＜0.05).结论运用pSilencerTM2.1-U6载体构建的STAT3-siRNA表达载体可有效抑制STAT3的表达及前列腺癌细胞的增殖.
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STAT3与SOCS3在乳腺癌组织中的表达及生物学行为相关性分析
目的:研究乳腺癌组织中信号转导和转录激活因子3(STAT3)和细胞因子信号转导抑制分子3(SOCS3)的表达与肿瘤分化、浸润、转移的关系.方法:应用组织芯片和免疫组织化学Envision法检测71例乳腺癌组织和41例非癌组织中STAT3、磷酸化STAT3、SOCS3的表达情况及其与临床病理参数的关系.结果:(1)在71例乳腺癌中STAT3、磷酸化STAT3和SOCS3的阳性表达率分别为78.9%、69.0%和29.6%,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05);(2)STAT3、磷酸化STAT3表达与乳腺癌的组织学分级、腋窝淋巴结转移、临床分期呈正相关(P＜0.05,P＜0.01),与患者年龄、瘤体大小和组织学类型无关(P＞0.05);SOCS3表达与乳腺癌组织学分级、腋窝淋巴结转移呈负相关(P＜0.05),与患者年龄、组织学类型、瘤体大小和临床分期无关(P＞0.05);(3)乳腺癌组织中STAT3、磷酸化STAT3表达与SOCS3表达分别呈负相关(P＜0.01).结论:乳腺癌STAT3、磷酸化STAT3的高表达和SOCS3的缺失表达与肿瘤发生发展、浸润转移密切相关;对其检测有助于判断乳腺癌的恶性程度及生物学行为.
关键词： 乳腺肿瘤 转录激活因子3 细胞因子信号转导蛋白抑制因子 免疫组织化学 组织芯片 -
转录激活因子3通过调控活化T细胞核因子1介导足细胞损伤
目的:探讨辅助转录因子——转录激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)调控活化T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)在足细胞损伤中的作用. 方法:(1)通过免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜,观察ATF3在不同肾小球疾病患者足细胞中的表达,并通过Western印迹验证不同肾小球疾病患者肾组织ATF3的表达情况;(2)体外培养小鼠永生化足细胞,用脂多糖(LPS) 100 μg/ml和ionomycin 2 μmol/L分别刺激足细胞0h、1h、2h、4h、6h后,采用实时荧光定量PCR (RT-PCR)和Western印迹检测ATF3 mRNA和蛋白的表达;(3)足细胞转染ATF3 siRNA后,通过Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡情况,RT-PCR和Western印迹检测凋亡相关标记物BAX、Bcl-2的表达,Western印迹检测足细胞标记蛋白podocin的表达;(4)通过Western印迹、免疫荧光染色、激光共聚焦观察在LPS和Ionomycin刺激下细胞核内ATF3表达情况;(5)通过免疫染色质共沉淀(ChIP)实验观察ATF3与核转录因子NFATc1启动子之间的关系,并通过RT-PCR和Western印迹检测足细胞沉默ATF3后对NFATc1的mRNA及蛋白表达的影响. 结果:(1)与正常肾组织相比,肾小球疾病患者肾组织足细胞ATF3表达明显增多;(2)用LPS和Ionomycin刺激足细胞,2h后ATF3的表达增高明显,随后降低,到6h基本恢复正常;(3)沉默ATF3基因后,细胞凋亡率减少,凋亡相关标记物BAX下调,Bcl-2上调,并部分逆转足细胞标记蛋白podocin的下调;(4)在损伤刺激后,细胞核内ATF3表达增多;(5)ChIP实验显示ATF3与核转录因子NFATc1的启动子区域有结合,在Ionomycin刺激后,结合量明显增加,且沉默ATF3基因后,NFATc1表达减少. 结论:辅助转录因子ATF3参与NFATc1介导的足细胞损伤,即通过结合NFATc1启动子,增强NFATc1表达,促进足细胞损伤.
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ATF3和CTGF基因在尿道下裂患者包皮中的表达及雌激素调控研究
目的:雌激素与尿道下裂的发生关系密切,本研究旨在比较尿道下裂患儿包皮和同龄正常儿童包皮中转录激活因子3(ATF3)和结缔组织生长因子(CTGF)的表达,明确二者与尿道下裂的关系,探寻雌激素引起尿道下裂的分子机制. 方法:从包皮中分离成纤维细胞并原代培养,用不同浓度(1.0 μmol/L、0.1μmol/L、10.0 nmol/L、1.0nmol/L、0.1 nmol/L)的17-β乙炔雌二醇(17-EE)处理2 h,或选择0.1 μmol/L的17-EE处理不同时间(0.5、1、2、4、8、16、24 h),观察17-EE对ATF3和CTGF表达的影响.MTT法检测17-EE对细胞增殖的影响,RT-PCR法观察成纤维细胞ATF3和CTGF表达情况. 结果:尿道下裂患者包皮中ATF3和CTGF的表达显著高于正常人包皮组织(P<0.05);高浓度的17-EE干预对包皮成纤维细胞有抑制作用;在17-EE干预早期(1～2 h)ATF3的表达呈现一过性增加;CTGF的表达在24 h内17-EE干预未见明显变化. 结论:ATF3和CTGF是与尿道下裂密切相关基因,雌激素可能通过上调ATF3和CTGF的表达参与调节生殖结节的异常发育,导致尿道下裂.
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瘦素诱导下乳腺癌组织中端粒酶反转录酶表达的机制研究
目的：研究瘦素诱导下端粒酶反转录酶与乳腺癌发生机制的关系。方法选取以乳腺癌MCF-7细胞系为处理对象，通过细胞培养传代得到足量乳腺癌细胞，以1×105个／孔种植于96孔板，数字表随机分为观察组（n＝48）和对照组（n＝48）。观察组以10 nmol／L瘦素处理细胞，对照组饥饿后不做任何处理。分别利用半定量RT-PCR和Western blot方法分析瘦素刺激前后两组端粒酶反转录酶mRNA、端粒酶反转录酶单表的表达情况的改变。设计针对信号转导和转录激活因子3（ STAT3）的特异性实验，下调乳腺癌细胞中STAT3的表达水平，用半定量RT-PCR法检测下调STAT3表达水平前后及瘦素刺激前后端粒酶反转录酶表达水平的变化。结果观察组经瘦素处理后，端粒酶反转录酶mRNA、端粒酶反转录酶蛋白都出现了倍数增加，其中端粒酶反转录酶mRNA比对照组增加了（3．2±0．5）倍（t＝2．675，P＝0．009），端粒酶反转录酶蛋白比对照组增加了（2．5±0．3）倍（t＝2．352，P＝0．032）。在人乳腺癌细胞MCF-7 STAT3表达水平下调的情况下，端粒酶反转录酶表达水平也随之下调（t＝2．019，P＝0．045），而且经瘦素处理后，瘦素对端粒酶反转录酶表达水平上调的现象也没有出现（t＝2．348，P＝0．037）。结论瘦素通过STAT3信号途径上调端粒酶反转录酶的表达参与乳腺癌的发生和发展。
