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脂肪酸结合蛋白3对足细胞脂肪代谢的影响
目的:观察脂肪酸结合蛋白3(FABP3)过度增加对足细胞脂肪代谢的影响. 方法:慢病毒载体转染小鼠永生化足细胞系(HSMPs)以构建稳定过表达FABP3的细胞系.将FABP3-siRNA转染至HSMPs中沉默FABP3,筛选干扰效率大的FABP3-siRNA片段进行后续干扰实验.实验分组:(1)正常足细胞组;(2) NC-siRNA足细胞组;(3) FABP3-siRNA足细胞组;(4)NC足细胞组;(5)FABP3过表达足细胞组;(6)正常足细胞+棕榈酸(PA)组;(7) NC-siRNA足细胞+PA组;(8) FABP3-siRNA足细胞+PA组;(9)NC足细胞+PA组;(10) FABP3过表达足细胞+PA组.比色法测定细胞内TG和游离脂肪酸的含量.定量PCR法检测各组细胞中过氧化物酶增殖激活受体α(PPARα)、酰基辅酶A氧化酶3(ACOX3) mRNA的表达.Western Blot法检测PPARα、ACOX3蛋白表达水平. 结果:与正常足细胞组相比,FABP3过表达足细胞组细胞内三酰甘油(TG)和游离脂肪酸水平增加(P＜0.05),而FABP3-siRNA足细胞组TG和游离脂肪酸水平下降(P＜0.05).不论在正常环境还是PA环境下,与正常足细胞组相比,FABP3过表达足细胞组PPARα mRNA和蛋白表达均下调(P＜0.05),而ACOX3 mRNA和蛋白表达均上调(P＜0.05);FABP3-siRNA足细胞组PPARα mRNA和蛋白表达均上调(P＜0.05),而ACOX3 mRNA和蛋白表达均下调(P＜0.05).与FABP3过表达足细胞组相比,FABP3-siRNA足细胞组PPARα mRNA和蛋白表达上调(P＜0.05),ACOX3 mRNA和蛋白表达下调(P＜0.05);加入PA后,FABP3过表达足细胞+PA组和FABP3-siRNA足细胞+PA组之间PPARα mRNA和蛋白表达、ACOX3 mRNA和蛋白表达统计学差异显著(P＜0.01). 结论:FABP3过度增加可导致足细胞脂肪代谢紊乱,抑制FABP3过度增加可纠正足细胞脂肪代谢紊乱状态.该研究结果提示抑制FABP3表达可能对代谢因素如糖尿病、肥胖、高脂血症所致的足细胞损伤有一定防御和治疗作用.
关键词： 脂肪酸结合蛋白3 过氧化物酶增殖激活受体α 酰基辅酶A氧化酶3 足细胞 -
FABP3过表达对斑马鱼ROS和线粒体ATP含量的影响
目的 探讨脂肪酸结合蛋白3(FA BP3)过表达对斑马鱼胚胎活性氧(ROS)及线粒体ATP含量的影响.方法 构建FABP3过表达载体,在斑马鱼受精卵的单细胞期进行胚胎显微注射(A组)；以野生型斑马鱼作为空白对照(C组).收集受精后24、48 hpf斑马鱼胚胎,采用流式细胞术和化学发光法分别检测斑马鱼ROS和ATP含量.结果 与C组相比,A组24 hpf时斑马鱼ROS水平降低,ATP含量增加(P＜0.05)；而在48 hpf时,两组间斑马鱼ROS水平和ATP含量无统计学差异(P＞0.05).结论FABP3过表达对斑马鱼线粒体功能起保护作用.
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FABP3过表达对斑马鱼胚胎心脏发育及线粒体DNA拷贝数的影响
目的 探讨脂肪酸结合蛋白(FABP)3过表达对斑马鱼胚胎死亡率、心脏发育形态及线粒体DNA拷贝数影响.方法 构建FABP3过表达载体,在斑马鱼受精卵的单细胞期进行胚胎显微注射(A组)；以野生型斑马鱼胚胎作为空白对照(C组).收集受精后12、24、48、72 hpf斑马鱼胚胎,利用体式显微镜观察其发育情况,并统计其死亡率；RT-PCR技术检测胚胎线粒体DNA拷贝数.结果 A组斑马鱼心脏在12、24、48、72 hpf各时间点发育大体形态、死亡率与C组比较均无明显差异.A组24 hpf时斑马鱼线粒体DNA的拷贝数高于C组(P＜0.05)；而在48、72 hpf时,两组间斑马鱼线粒体DNA拷贝数无统计学差异(P＞0.05).结论 FABP3过表达对斑马鱼胚胎死亡率、心脏发育的形态无明显影响,对线粒体功能起保护作用.
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FCCP对FABP3基因表达沉默的P19细胞线粒体功能的影响
目的 探讨羰基-氰-对-三氟甲氧基本腙(FCCP)对脂肪酸结合蛋白3(FABP3)基因表达沉默的P19细胞线粒体功能的影响.方法 构建FABP3表达沉默载体(A组)及相应的空载体(B组),包装病毒后感染P19细胞,建立稳定转染FABP3沉默的P19细胞株,采用实时定量PCR检测干扰效率.给予FCCP 2.5μmol/L(C组)、5μmol/L(D组)干预FABP3沉默的P19细胞,采用荧光素酶化学发光法检测细胞ATP含量,流式细胞术观察线粒体膜电位的变化.结果 B组FABP3基因表达量较A组下调(0.50±0.08 vs.2.23±0.42) (P＜0.05).与A、B组相比,C、D组细胞ATP生成减少(2.47±0.58、1.05±0.13 vs.0.09±0.03、0.12±0.02) (P＜0.05),而细胞线粒体膜电位升高(358.36±12.23、389.66±12.13 vs.437.35±9.27、473.21±19.65) (P＜0.05).结论 FABP3基因在维持P19细胞线粒体功能中发挥重要作用.
关键词： 脂肪酸结合蛋白3 P19细胞 线粒体功能 羰基-氰-对三氟甲氧基本腙 -
FABP3基因荧光载体构建及其蛋白的亚细胞定位
目的 构建脂肪酸结合蛋白3(FABP3)基因的荧光表达载体FABP3-pEGFP-N2,并应用绿荧光融合蛋白技术检测FABP3蛋白的亚细胞定位.方法 RT-PCR法获得FABP3基因编码框,克隆到pEGFP-N2载体中,利用脂质体将构建的表达载体转染P19细胞后,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察细胞内FABP3蛋白定位.结果 成功克隆FABP3基因片段,并将其重组到pEGFP-N2载体中.荧光显微镜和激光共聚焦显微镜显示,FABP3蛋白主要分布于P19细胞的胞浆和胞核中.结论 成功构建了FABP3-pEGFP-N2真核表达载体,FABP3在P19细胞的胞浆和胞核中呈弥漫分布特点.
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FABP3对P19细胞增殖的影响及其生物信息学分析
目的 探讨脂肪酸结合蛋白(FABP)3基因过表达对P19细胞分化、增殖的影响及FABP3基因的生物信息学特征.方法 构建FABP3过表达载体及相应的空载体,转染P19细胞,经0.9%二甲基亚砜(DMSO)诱导分化为心肌细胞,定量PCR检测肌钙蛋白T(cTnT)和转录调控因子GATA4基因的表达,MTT法检测P19细胞增殖,应用在线数据库软件分析FABP3的核苷酸基本特征、蛋白质理化性质、亚细胞定位等.结果 与空载体相比,FABP3基因过表达能抑制cTnT、GATA4 mRNA表达及P19细胞增殖(P＜0.05或P＜0.01).生物信息学分析显示,FABP3基因mRNA全长1097 bp,开放阅读框长402 bp,编码133个氨基酸,相对分子质量为14 858 Da,蛋白主要位于胞浆.结论 FABP3基因过表达显著抑制心肌细胞分化、增殖,生物信息学分析为进一步研究该基因奠定了基础.
