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抗重组人骨唾液酸蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
目的 研制重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性.方法 以纯化的rhBSP免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗rhBSP mAb;用亚型鉴定试剂条鉴定IgG亚类;ELISA鉴定mAb的特异性和效价.结果 获得2株能稳定分泌特异性mAb的抗rhBSP的杂交瘤细胞系AHB1和AHB5,Ig亚类分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ型,其效价分别为1×10-3和1×10-7.腹水mAb经Protein A亲和色谱柱纯化后,纯度达92%以上.结论 获得抗rhBSP的mAb,为进一步研究BSP的生物学功能和用于临床诊断实验研究创造了条件.
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重组人骨唾液酸蛋白的纯化及生物学活性研究
目的对毕赤酵母表达的重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)进行纯化和活性研究,为进一步研究BSP功能活性,揭示相关病理机制奠定基础.方法毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPICZαA-hbsp工程菌能高效分泌表达rhB-SP,采用Ni-NTA介质以亲和色谱法纯化rhBSP.通过羟基磷灰石(HA)晶体生长抑制实验、细胞黏附实验和鸡胚尿囊绒膜实验分析rhBSP的生物学活性.结果纯化的rhBSP达到电泳纯,并能抑制HA晶体生长,可介导乳腺癌细胞黏附和促进血管生成.结论纯化的rhBSP具有良好的生物学活性,可用于进一步研究BSP相关的病理、生理机制.
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双表达盒人骨唾液酸蛋白毕赤酵母工程细胞的构建
目的构建含人骨唾液酸蛋白(hBSP)双表达盒的毕赤酵母工程细胞,为hBSP在毕赤酵母中的高效非融合分泌表达奠定基础.方法用PCR方法扩增hBSP基因,将其亚克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,并在此基础上构建含有双表达盒的重组pPICZαAN-2×hBSP载体,电转化毕赤酵母GS115,通过Zeocin高抗性筛选转化子并对其表型进行PCR鉴定.结果得到GS115/pPICZaAN-hBSP和GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞.结论GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞中含双表达盒hBSP.
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人骨唾液酸蛋白酵母工程细胞的构建与表达
目的构建表达重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)的巴斯德毕赤酵母工程细胞,实现rhBSP的酵母胞外分泌性高表达.方法通过PCR扩增获得人BSP基因后,构建重组表达载体pPICZaA-hbsp,经电转化导入到毕赤酵母GS115菌中,获得GS115/pPICZaA-hbsp工程菌,通过Zeocin高抗性筛选和摇瓶发酵筛选出高表达rhBSP的菌株,并进行高密度发酵提高表达量.结果 rhBSP分子量接近66 000,产物可达上清液总蛋白的80%,浓度约0.248 g/L.结论基因工程菌GS115/pPICZaA-hbsp能高效地表达rhBSP并分泌到胞外.
