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人脐带间质干细胞来源的外切体对大鼠心肌细胞缺血/再灌注损伤的作用
目的:研究人脐带间质干细胞来源的外切体(hucMSC-exosome)对大鼠缺血/再灌注(I/R)损伤心肌细胞的修复作用.方法:在体内,建立大鼠I/R模型:经冠状动脉左前降支(LAD)结扎缺血30 min后取消结扎恢复灌注,与此同时,尾静脉注射hucMSC-exosome.在体外,建立大鼠H9C2(2-1)心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型:细胞于无血清低糖培养基中缺氧(5% CO2/93% N2)24 h后,用含hucMSC-exosome的高糖10% FBS培养液复氧24 h.采用MTT法、TUNEL法、心肌酶谱以及线粒体膜电位等方法检测大鼠心肌细胞的增殖和凋亡状况.结果:在体内,心肌细胞经I/R损伤后,hucMSC-exosome与hucMSC处理组较PBS处理组血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)值均下降;TUNEL结果显示,前两组较PBS处理组心肌细胞凋亡明显减少;在体外,心肌细胞经H/R损伤后,MTT实验表明细胞增殖显著减弱,hucMSC-exosome作用后,TUNEL及线粒体膜电位(ΔΨm)结果分别显示受损心肌细胞凋亡以及膜电位下降明显减少.结论:hucMSC-exosome能有效抵抗心肌细胞因缺血/再灌注损伤而引起的细胞凋亡.
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人脐带间质干细胞的CM-Dil标记及其移植在急性肾损伤大鼠体内的示踪研究
目的:探讨人脐带间质干细胞( human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs)用CM-Dil染料标记之后生物学特性及体内定位示踪情况.方法:采用脐带组织块贴壁培养法分离人脐带间质于细胞,用CM-Dil染料标记第3代hucMSCs；采用细胞计数法分析CM-Dil标记后hucMSCs的生长变化情况；通过活体成像仪观察CM-Dil染料标记的hucMSCs移植于急性肾损伤大鼠后的体内定位.结果:CM-Dil染料标记hucMSCs的效率很高；标记后的hucMSCs生长增殖能力没有发生明显变化；体内示踪可以观察到标记的hucMSCs.结论:CM-Dil标记不影响hucMSCs的生长增殖特征,并且能够在体内示踪,为后续研究提供了实验基础.
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人脐带间质干细胞来源的外切体对大鼠肾小管上皮细胞缺氧损伤的干预作用
目的:观察体外缺氧损伤的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡情况以及分离纯化人脐带间质干细胞来源的外切体( hucMSCs-exosomes)对其干预作用.方法:将体外培养的NRK-52E细胞随机分为对照组、缺氧损伤模型组和hucMSCs-exosomes (0.5,1.0 mg/ml)预处理组.随后进行细胞计数,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2,bax)的表达变化,流式细胞仪检测细胞周期以及凋亡率的变化.结果:与对照组相比,模型组细胞凋亡相关指标均明显升高,细胞计数下降(P＜0.01),Bcl-2/bax表达下调(P＜0.01),细胞周期S期阻滞以及凋亡细胞比例明显增多.而hucMSCs-exosomes预处理组可明显改善缺氧损伤时的细胞活力,上调Bcl-2/bax的表达,改善细胞周期和凋亡细胞的比例(P均＜0.05).结论:NRK-52E在缺氧损伤时有明显的细胞凋亡,而hucMSCs-exosomes预处理可能通过抗凋亡途径减轻缺氧时细胞的损伤.本实验可为进一步研究hucMSCs-exosomes在组织损伤修复中的生物学功能和相关机制提供实验基础.
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脐带间质干细胞心肌样分化中干细胞标志物的表达
目的:探讨人脐带间质干细胞 (human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs)在体外特定条件下是否可以定向分化为心肌样细胞及干细胞标志物的表达变化.方法:采用脐带组织块贴壁培养方法分离人脐带间质干细胞,用第2代hucMSC进行体外心肌细胞诱导分化;采用 RT-PCR、透射电镜等鉴定心肌细胞,流式细胞术、实时荧光定量PCR及蛋白质印迹分析干细胞相关基因及蛋白表达.结果:RT-PCR显示诱导组细胞转录心肌钙蛋白T、β-肌球蛋白重链、心房利钠多肽水平增加;在透射电镜下,诱导后细胞具有条索状肌丝结构;流式细胞仪检测未见细胞表面标志改变;而实时荧光定量PCR及蛋白质印迹显示干细胞相关基因及蛋白Nanog、Oct4、Sox2、Sall4在5-氮胞苷(5-azacytidine,5-Aza)诱导后的hucMSCs中表达显著下降.结论:人脐带间质干细胞体外经5-氮胞苷诱导可定向分化为心肌样细胞,其分化可能与干细胞相关基因及蛋白表达下调有关,为深入研究hucMSCs心肌分化机制奠定了实验基础.
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hHGF腺病毒载体的构建及其在人脐带间质干细胞中的表达
目的:构建人重组肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)基因腺病毒载体(Ad-HGF),转染人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hucMSCs),为转基因治疗提供实验基础.方法:设计含有SalⅠ及XbaⅠ酶切位点的引物,PCR扩增hHGF,将扩增产物克隆到带有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的pAdTrack-CMV穿梭质粒上.重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183中同源重组,筛选获得含有hHGF的重组腺病毒质粒,PCR、酶切鉴定并测序.重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化,脂质体转染293A细胞,经3轮扩增,制备高效表达的AdGFP/HGF,并转染hucMSCs.结果:重组腺病毒质粒经PCR和SalⅠ,XbaⅠ酶切鉴定,证实含有HGF基因,测序结果和设计片段的序列一致.荧光显微镜下发现293A细胞发光率几乎为100%,感染的hucMSCs亦可表达绿色荧光蛋白.结论:成功构建了hHGF腺病毒表达载体,并获得高滴度的病毒, 能高效感染hucMSCs,为后续研究奠定了基础.
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人脐带间充质干细胞对小鼠自然衰老过程中骨髓脂肪化的影响
目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)对小鼠自然衰老过程中骨髓脂肪化的延缓作用.方法:从新生儿脐带分离间充质干细胞,与成年小鼠骨髓MSC进行生长增殖与成骨成脂分化比较.将6月龄的BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,前者输注hUC-MSC(5×10~5 cells/mouse),每月1次,共6次;后者输注生理盐水.干预后第6个月观察并比较2组小鼠骨髓切片及PPARγ蛋白表达情况.结果:hUC-MSC增殖活性和成骨分化能力明显强于成年小鼠骨髓MSC,而成脂能力相对较弱.骨髓切片显示实验组骨髓脂肪组织明显少于对照组,PPARγ蛋白的表达量也较低.结论:脐带MSC作为一种新来源的MSC,能够抑制小鼠自然衰老进程中骨髓的脂肪化,有望应用于抗衰老研究.
