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SynGAP(1-700aa)中670-685aa缺失突变质粒的构建及表达
目的:缺失突变SynGAP(1-700 aa)-Flag中的670-685aa片段,为后续实验中新的药物靶点的鉴定提供可靠理论依据.方法:以前期构建好的pCMV-SynGAP (1-700aa)-Flag质粒为模板,重叠延伸PCR技术缺失突变670-685aa片段,扩增出目的片段;限制性内切酶将载体线性化,然后分别纯化目的片段与线性化载体;利用同源重组技术连接目的片段与线性化载体,获取重组质粒;PCR技术鉴定重组质粒构建成功,测序进一步验证质粒碱基正确;将质粒转入293T细胞,免疫印迹鉴定能否成功表达.结果:重叠PCR成功缺失突变670-685aa片段,成功构建重组质粒,且测序正确.免疫印迹结果表明,SynGAP (1-700aa)缺失突变670-685aa片段后仍可成功表达.结论:成功缺失突变SynGAP(1-700aa)中的670-685aa片段,并且在细胞株中稳定表达.该质粒的成功构建,为我们的后续研究奠定实验基础.
关键词： SynGAP 重叠延伸聚合酶链式反应 缺失突变 -
突触后致密部蛋白PSD－93与SynGAP相互作用位点的鉴定
目的：鉴定突触后致密部蛋白PSD－93与SynGAP结合位点。方法分别构建PSD－93、SynGAP质粒，免疫印迹检测各个重组质粒是否表达，免疫共沉淀检测PSD－93与SynGAP的结合情况；分别缺失突变PSD－93的95－105aa和170－190aa残基以及SynGAP的670－685aa残基，免疫印迹检测各个突变质粒是否表达，免疫共沉淀检测两者的结合情况。结果 PSD－93（1－199aa）－HA可在细胞中过表达，PSD－93（1－109aa）－HA不表达或者表达蛋白不稳定；SynGAP的3个质粒均可在细胞内过表达；PSD－93（1－199aa）均可与SynGAP的3个片段相结合。 PSD－93（1－199aa）缺失突变95－105aa片段后，可在细胞内过表达，且与SynGAP的3个片段均可结合，而敲除170－190aa片段则不能与SynGAP蛋白结合；同样，突变SynGAP（670－685aa）片段则不能与PSD－93蛋白结合。结论 PSD－93与SynGAP结合的位点分别位于PSD－93的170－190aa序列以及SynGAP的670－685aa序列。
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左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型大鼠海马神经元突触功能可塑性相关蛋白的影响
目的 针对NR受体亚型及其下游分子CaMKⅡ、SynGAP的表达情况,探索左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型大鼠海马神经元突触功能可塑性的影响.方法 复制糖尿病并发抑郁症大鼠模型并随机分为4组:模型组,阳性药组(二甲双胍0.18 g·kg-1+盐酸氟西汀1.8 mg·kg-1),左归降糖解郁方高、低剂量组(32.82,8.20 g·kg-1),以正常大鼠为空白对照组.采用Morris水迷宫检测大鼠的空间学习记忆能力,Western-blotting实验检测大鼠海马NR2A、NR2B、CaMKⅡ、SynGAP的表达情况.结果 与空白对照组比较,模型组大鼠逃避潜伏期延长,空间探索时间减少(P＜0.05),NR受体亚型NR2A、NR2B及CaMKⅡ、SynGAP的表达明显减少(P＜0.01);与模型组比较,阳性药组和左归降糖解郁方高剂量组逃避潜伏期显著缩短(P＜0.05),空间探索时间显著增加(P＜0.05),NR2A、NR2B、CaMKⅡ、SynGAP的表达明显增多(P＜0.05或0.叭).结论 左归降糖解郁方可以明显增强糖尿病并发抑郁症大鼠的学习记忆能力,改善认知功能障碍,缓解抑郁症状,该作用可能与调节海马NR受体亚型NR2A、NR2B及其下游分子CaMKⅡ、SynGAP的表达,保护海马神经元突触功能可塑性有关.
