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X线照射对宫颈癌HeLa细胞醛缩酶A表达和定位的影响
目的:观察宫颈癌HeLa细胞转染醛缩酶A(aldolaseA,ALDOA)后,在X线作用下ALDOA在细胞内定位的改变,以及其对细胞存活率的影响.方法:克隆出ALDOA全长编码序列,构建真核表达质粒pECFP-C1-ALDOA,实验组通过脂质体介导将pECFP-C1-ALDOA转染HeLa细胞,设载体pECFP-C1作为阴性对照,各组均给予X线照射,荧光显微镜观察照射前后HeLa细胞中pECFP-C1-ALDOA和pECFP-C1表达及定位的变化,用XTT法检测细胞存活率的改变.结果:双酶切和DNA测序证明所构建质粒正确;荧光显微镜下观察HeLa细胞内pECFP-C1-ALDOA主要分布于胞浆,pECFP-C1为全细胞均匀分布;经X线照射24 h后胞浆中的pECFP-C1-ALDOA逐渐转至胞核,而pECFP-C1在细胞内的定位则不发生明显改变;经XTT法检测,发现X线照射后,转染pECFP-C1-ALDOA质粒的细胞存活率明显高于转染pCFP-C1的对照组细胞.结论:抑制ALDOA的表达,可使X线更易诱导宫颈癌细胞的死亡,因此其可能作为官颈癌放射治疗的新靶点.
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ANGPTL4基因调控黑色素瘤细胞醛缩酶A表达水平的机制
目的:探讨黑色素瘤细胞血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like 4,ANGPTL4)对醛缩酶A(aldolase A,ALDOA)表达水平的影响及其机制.方法:分别扩增和沉默黑色素瘤细胞系WM-115及WM-266-4 ANGPTL4基因,运用PKC激动剂及阻断剂处理转染细胞.检测ALDOA在人黑色素瘤细胞中mRNA及蛋白质水平的表达,荧光素酶测定ALDOA基因启动子活性.结果:ANGPTL4基因扩增的黑色素瘤细胞组,ALD OA在mRNA及蛋白质的水平的表达均增高,ALDOA基因的启动子活性增加,且可被PKC阻断剂抑制(P＜0.05).而在ANGPTL4基因沉默细胞组中ALDOA在mRNA及蛋白质水平的表达均减低,ALDOA基因的启动子活性降低,且可被PKC激动剂恢复(P＜0.05).结论:ANGPTL4基因可通过PKC依赖途径从ALDOA基因转录及翻译水平上调人黑色素瘤细胞中ALDOA的表达.
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人醛缩酶A干扰RNA真核表达载体的构建
目的 构建4个人醛缩酶A (aldolaseA,ALDOA)公共序列的干扰RNA真核表达载体,转染人脑神经胶质细胞U251细胞,为醛缩酶A成为人脑肿瘤标志物提供实验基础和有价值的资料.方法 ①构建4个新靶点醛缩酶A干扰RNA真核表达载体并用双酶切和测序鉴定;②用脂质体法瞬时转染上述4个载体到U251细胞株.结果 ①成功构建了4个新靶点的醛缩酶A干扰RNA真核表达载体即pGPU6/GFP/Neo-ALDOA-1,pGPU6/GFP/Neo-ALDOA-2,pGPU6/GFP/Neo-ALDOA-3和pGPU6/GFP/Neo-ALDOA-4;②在U251细胞中有绿色荧光蛋白表达.结论 成功构建并筛选出效果好的新靶点MBP干扰RNA真核表达载体.
关键词： 干扰RNA 醛缩酶A 神经胶质细胞U251
