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反义BTEB2腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达
目的:构建反义BTEB2重组腺病毒载体,以研究BTEB2反义RNA对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及动脉再狭窄的影响. 方法:从培养的大鼠VSMC中提取总RNA,通过RT-PCR制备BTEB2 cDNA,将BTEB2 cDNA反向连接至腺病毒穿梭质粒pDC315中,构建重组穿梭质粒pDC315 ASBTEB2, 将其与腺病毒基因组质粒pBHGlox ΔE1,3Cre共转染293细胞获得重组腺病毒,采用PCR方法对其进行鉴定;用重组腺病毒感染VSMC,通过RT-PCR检测BTEB2反义RNA在VSMC中的表达. 结果:在病变293细胞的冻融上清中含有反义BTEB2重组腺病毒, 其滴度为5×109 ml.VSMC被重组腺病毒感染后,可检测到BTEB2反义RNA的表达. 结论:成功构建了反义BTEB2重组腺病毒载体;重组腺病毒可在VSMC中表达BTEB2反义RNA,为进一步研究BTEB2反义RNA对VSMC增殖及动脉再狭窄的影响奠定了基础.
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腺病毒介导BTEB2反义RNA对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用
目的构建携带反义锌指转录因子2(basic transcription element binding protein 2,BTEB2)基因的重组腺病毒载体并研究BTEB2反义RNA对平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖的影响.方法从培养的大鼠VSMC中提取总RNA,通过RT-PCR制备BTEB2 cDNA,将其反向克隆至腺病毒载体,构建携带反义BTEB2基因的重组腺病毒Ad.ASBTEB2;用Ad.ASBTEB2转染VSMC,通过RT-PCR检测BTEB2反义RNA在VSMC中的表达;经免疫印迹法分析BTEB2反义RNA对BTEB2蛋白质表达的抑制作用;通过MTT比色法和流式细胞仪分别检测BTEB2反义RNA对VSMC增殖及细胞周期的影响.结果构建的重组腺病毒载体经鉴定正确,其滴度为5×10 9/ml;VSMC被重组腺病毒感染后,可检测到BTEB2反义RNA的表达;Ad.ASBTEB2转染可明显抑制VSMC的BTEB2蛋白表达及血清诱导的VSMC增殖,使VSMC出现明显的G0/G期阻滞.结论成功构建了携带反义BTEB2基因的重组腺病毒载体;重组腺病可在VSMC中表达BTEB2反义RNA;BTEB2反义RNA对VSMC增殖有明显的抑制作用.
