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应用CRISPR/Cas9慢病毒系统建立Nestin基因敲除的小鼠肾足细胞系
目的 基于CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除Nestin基因的条件永生性小鼠肾足细胞株(mouse podocyte,MP).方法 利用Cas9过表达慢病毒构建条件性永生小鼠足细胞Cas9过表达稳转细胞系(CAS9/MP).设计Nestin基因的3个位点(KO1、KO2、KO3),并构建3对靶向Nestin基因的sgRNA寡核苷酸序列,将其连接进GV371质粒中,测序验证后,包装慢病毒颗粒,感染构建好的CAS9/MP,嘌呤霉素筛选(Puromycin)阳性克隆细胞,Cruiser TM酶切检测CAS9-sgRNA对目的基因的剪切活性.结果 成功构建了CAS9/MP及GV371-Nes-sgRNA重组载体,CruiserTM酶法验证表明,CAS9-sgRNA2具有剪切活性.结论 建立能稳定敲除Nestin基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统,成功获得Nestin敲除的MP稳转细胞株.为进一步研究Nestin在足细胞中的作用机制奠定基础.
关键词: CRISPR/Cas9 Nestin基因敲除 小鼠肾足细胞 -
雷公藤多苷干预舒尼替尼引起的小鼠肾足细胞凋亡及相关蛋白表达的机制研究
目的:观察舒尼替尼对体外培养小鼠肾足细胞的影响,并探讨雷公藤多苷( TWP )对舒尼替尼所致小鼠肾足细胞损伤的保护作用及其机制。方法体外培养小鼠肾足细胞,不同分组给药处理后,采用MTT法、流式细胞术、Western blot法检测小鼠肾足细胞的增殖抑制率、凋亡率及相关蛋白(Nephrin、CD2AP)的表达情况。结果小鼠肾足细胞增殖抑制率随着舒尼替尼浓度及作用时间的增加而增加(P<0.01);48 h凋亡率随舒尼替尼浓度增加而增加(P<0.01)。TWP可降低48 h舒尼替尼引起的小鼠肾足细胞增殖抑制率和凋亡率(P<0.05),同时可抑制舒尼替尼引起的Nephrin、CD2AP表达量降低(P<0.05)。结论舒尼替尼可损伤小鼠肾足细胞;而TWP通过上调Nephrin、CD2AP蛋白表达减轻舒尼替尼导致的足细胞损伤。