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CRX基因突变影响视紫红质转录表达和NRL蛋白稳定性的细胞学研究
目的 在细胞水平上,探讨存在和缺乏神经视网膜亮氨酸拉链(NRL)的条件下,视锥-视杆细胞同源异形框基因(CRX)突变型对调控视紫红质基因转录表达的影响,并分析CRX突变型对CRX和NRL蛋白稳定性的影响.方法 实验研究.分别构建携带野生型和c.C766T (p.Gln256X)无义突变型的CRX基因,以及共表达NRL基因和牛视紫红质基因启动子萤光素酶(pBR130-1uc)的表达载体,分别转染体外培养的293T细胞和ARPE-19细胞,再行双荧光素酶检测分析和Western blotting实验.以持家蛋白GAPDH作为内参照.结果 与野生型CRX蛋白的表达导致牛视紫红质启动子表达5倍的激活率相比,CRX/c.C766T(p.Q256X)突变所造成的相应激活率降至1/4.共表达野生型CRX和NRL基因后,激活率增高至30倍,而共转染CRX/c.C766T和NRL后,牛视紫红质蛋白的活性降至1/13.以持家蛋白GAPDH作为内参,可见存在CRX/c.C766T突变时,CRX蛋白的稳态水平大幅下降,且CRX/c.C766T突变型对NRL蛋白的稳态有一定的影响,出现NRL增高的现象.结论 在细胞水平上,CRX基因的c.C766T(p.Q256X)突变可降低所调控的视紫红质蛋白的表达,并对CRX蛋白和NRL蛋白的稳态均造成一定的影响.
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与NRL相互作用所必需的OPTN结合区域的确定
背景 视神经蛋白(OPTN)基因是青光眼和肌萎缩性脊髓侧索硬化的致病基因,在眼部视网膜组织中的表达多.我们先前的研究分离出与OPTN相互作用的蛋白质,确定其中之一为视网膜色素变性的致病基因——碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子,即神经视网膜亮氨酸(NRL)拉链,并证实OPTN和NRL两蛋白间存在相互作用. 目的 确定与NRL相互作用所必需的OPTN蛋白结合区域. 方法 构建一系列带FLAG标签的OPTN部分片段缺失质粒,分别与带血凝素标记的NRL(HA-NRL)共转染HeLaS3细胞.用抗HA和抗FLAG标签抗体分别对细胞质和细胞核提取物进行免疫共沉淀和Western blot检测,分析两蛋白质间的相互结合方式,以确定NRL与OPTN蛋白的结合区域.结果 在OPTN的第一、第二和第三缺失区域质粒转染细胞的细胞核组分中均检测出血凝素标记的NRL(HA-NRL)免疫共沉淀条带,但在第四缺失区域质粒中不产生此HA-NRL条带.从所有缺失质粒及全长OPTN质粒转染细胞的细胞质组分中均未观察到NRL条带.结论 本研究进一步证实OPTN和NRL在HeLaS3细胞核内的相互作用,并明确其蛋白结合区域.在共表达NRL和OPTN的HeLaS3细胞中,Flag-OPTN可与HA-NRL相互结合,且OPTN的尾端区域(423-577)是结合NRL所必需的.
关键词： 视神经蛋白 神经视网膜亮氨酸拉链 蛋白质相互作用 免疫共沉淀 蛋白结合区域
