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pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒的构建及其在活细胞内的作用
目的:构建pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC 155-NT21MP真核表达质粒,利用双分子荧光互补( BiFC)技术,在活细胞内直接观察趋化因子受体4(chemokine receptor 4、CXCR4和CD184)与CXCR4抑制性多肽的相互作用.方法:应用化学合成法获得巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)N端21肽(N-terminal 21-mer peptide,NT21MP)编码的基因序列,克隆至经Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pBiFC-VC155中,筛选含有目标基因的正确克隆.利用RT-PCR扩增人乳腺癌细胞株SKBR3的CXCR4全长基因后,T-A亚克隆至经Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pBiFC-VN173载体中.然后,经酶切鉴定及DNA测序分析2个基因是否正确连接至真核表达载体中.应用脂质体转染的方法共转染pBiFC-VC155-NT21 MP和pBiFC-VC155-CXCR4至细胞株COS-7中,在荧光显微镜下观察NT21MP与CXCR4在胞内的相互作用.结果:经DNA测序及同源性对比,证实pBiFC-VC155-NT21MP和pBiFC-VN173-CXCR4重组栽体构建成功；基因片段与NCBI基因库vMIP-Ⅱ和CXCR4基因CDS序列同源性达99.9％.BiFC法观察NT21MP与CXCR4在细胞内结合出现的荧光信号,该信号分布细胞内.结论:本实验成功构建了应用BiFC技术的真核表达载体,并且在活细胞内检测到NT21MP与CXCR4的互相结合.
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人碱性成纤维生长因子重组质粒的构建
目的 通过基因体外拼装(PBGA)获得带有BamHI和Pst Ⅰ内切酶位点的重组人碱性成纤维生长因子(rhbFGF)cDNA,并利用TA克隆技术构建含rhbFGF基因片段的重组质粒.方法 (1)根据己知的hbFGF氨基酸序列并结合乳酸链球菌蛋白表达密码子来设计适于乳链菌内表达的hbFGF基因序列,分别在5′和3′端设计BamHI和Pst Ⅰ酶切位点,通过DNASTAR 6.0将上述目的基因序列设计成22个可以相互重叠的寡核苷酸片段,bFGFI -bFGF22.(2)采用基因拼装技术,通过PCR反应,拼接1～ 22段寡核苷酸片段,合成带有设定内切酶位点的rhbFGFcDNA.(3)构建rhbFGF TA克隆载体.纯化上步拼接rhbFGF基因片段,产物与PMD1 8-T VECTOR进行连接反应.连接产物转化于E.coli TOP10感受态细胞,涂板、筛选、培养后提质粒,酶切鉴定并测序.结果 (1)体外拼装带有BamHI和Pst Ⅰ内切酶酶切位点的rhbFGFcDNA经2％琼脂糖电泳验证；(2)构建了载体hrbFGF-PMD18,经酶切鉴定和测序证实碱基序列完全正确.结论 利用PBGA和TA克隆技术可成功构建rhbFGF-PM D18重组质粒.
关键词： 重组蛋白质类/遗传学 成纤维细胞生长因子2/遗传学 质粒 遗传载体
