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弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆与原核表达
目的 克隆弓形虫RH株次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)基因,构建原核表达载体,并表达该重组蛋白.方法 收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA,在设计合成的引物中引入BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.应用RT-PCR扩增弓形虫HXGPRT基因片段,插入克隆载体pMD18-T,提取重组质粒,双酶切获得目的基因,插入原核表达质粒pET28a,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达.结果 从弓形虫RH株cDNA中扩增出693 bp的HXGPRT基因片段;含pET28a/HXGPRT的宿主菌经诱导后,获得与预期分子量相符的表达产物,Western blotting提示重组蛋白能够被弓形虫患者血清中的IgG抗体识别,获得纯化的重组蛋白.结论 成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取HXGPRT基因,构建pET28a/HXGPRT重组质粒,并高效表达,为进一步研究提供了条件.
关键词： 弓形虫 次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 克隆 表达 -
siRNA干扰嘌呤补救合成途径的关键酶对弓形虫增殖的抑制作用
目的 探讨siRNA同时干扰嘌呤补救合成途径中两个关键酶对弓形虫增殖速率的影响.方法 将针对腺苷激酶(AK)和次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)的siRNA同时电转染弓形虫,然后将弓形虫接种人包皮成纤维细胞(HFF),24h和40h后Giemsa染色,光镜下计数假包囊内弓形虫速殖子数目,计算弓形虫平均倍增次数.同时将弓形虫进行模拟电转,接种HFF细胞后,不加磺胺嘧啶进行培养作为阴性对照,加入10μg/mL磺胺嘧啶培养作为阳性对照.结果 在接种HFF细胞后24h,4μmol/L的AK siRNA786和HXGPRT siRNA415联合电转弓形虫、阳性对照组及阴性对照组弓形虫的平均倍增次数分别为:1.64±0.95、1.04±0.88及2.32±0.90,前两组与后者相比倍增次数明显减少(P<0.05).在接种后40h,siRNA联合电转弓形虫与阳性对照组弓形虫的平均倍增次数分别为3.00±1.04,2.56±1.04,与阴性对照组相比(3.60±0.80)差异有显著性(P<0.05).结论 嘌呤补救合成途径中的两个关键酶-AK和HXGPRT被其siRNA同时抑制后,弓形虫在细胞内的增殖速率显著减缓.
