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基于FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法
目的 利用FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法.方法 构建针对破伤风毒素和B型肉毒毒素的双荧光标记底物的重组表达质粒,表达并纯化荧光标记底物重组蛋白;利用A型肉毒毒素轻链(ALc),B型肉毒毒素轻链(BLc)和破伤风毒素轻链(TIc)分别对目的蛋白进行酶切反应.对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件进行优化.酶动力学参数分别测定TLc和BLc切割底物荧光标记底物的Km和Kcat值.结果 设计并成功构建荧光标记底物的重组表达质粒.表达并纯化后获得纯度为90％左右的重组蛋白,命名为CY-VAMP.利用ALc、BLc和TLc分别对CYVAMP进行酶切,CYVAMP能被BLc和TLc识别切割而不能被ALc切割.对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件优化得到:CYVAMP较适宜的范围为0.2～32 μ.mol/L,酶标仪滤光片灵敏度设定的较合适的设置范围在65～110;(对于96孔板)动态实时检测间隔时间2 min较为合适,检测持续时间从30 min到120 min较合适.CYVAMP在内肽酶BLc作用下随反应时间变化与荧光值528与485比值作图大时在1.5左右,小在0.5左右.酶动力学参数测定得到BLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(17.6±2.6)μmol/L和(4.16+0.28) s-1.TLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(40.8±3.5)μmol/L和(2.65±0.32)s-1.结论 成功构建基于FRET技术的分析法能满足对破伤风毒素和B型肉毒毒素的检测及抑制剂的高通量体外筛选所需.
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共振能量转移(RET)技术的发展及应用
蛋白质间的相互作用是生命活动的基本形式之一,这种作用对细胞内信号转导,基因的转录激活等有重要意义.传统的检测方法存在损伤细胞结构、不能实时动态观察蛋白相互作用的缺点.RET技术的发展,解决了上述问题,为我们更好的研究蛋白质相互作用提供了强有力的工具.本文从FRET和BRET的基本原理、新型RET技术的发展等方面进行介绍,并将FRET和BRET进行比较,以便更好的选择研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法.
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利用FRET技术实时检测Bid蛋白在TNF-α诱导PC12细胞凋亡过程中的作用
目的 在活细胞中实时检测TNF-α诱导PC12细胞凋亡过程中Bid蛋白的作用并探讨PC12细胞凋亡的信号通路.方法 利用基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理设计的荧光探针pFRET-Bid( YFP-Bid-CFP)转染PC12细胞后,在激光共聚焦显微镜下实时检测Bid蛋白的切割情况,并采用专用软件进行数据分析.结果 TNF-α诱导细胞凋亡的过程中,在短时间内(3 h)就凋亡的细胞中观测不到bid的切割,而在8h后凋亡的细胞中却观测到了hid的切割.结论 通过分析实验结果推测不同时间凋亡的细胞经过的信号通路是不同的,一个是不通过线粒体的较快途径,一个是需要通过线粒体的较慢途径.
