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弓形虫表面抗原SAG2基因片段的克隆与原核表达
目的扩增弓形虫主要表面抗原(SAG2)编码基因片段并进行重组表达.方法设计合成1对引物,从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列,以低熔点琼脂糖回收纯化,并以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切、纯化后,再插入表达载体pGEX-4T-2,经PCR和双酶切筛选,测序验证后,在大肠杆菌中进行表达,并用SDS-PAGE和Westem blot鉴定.结果从弓形虫核酸提取物中扩增出约477bp的SAG2基因,构建成功了重组质粒pGEX-4T-2-SAG2;SAG2基因在大肠杆菌中得到高效表达.SDS-PAGE电泳pGEX-4T-2-SAG2的融合蛋白条带的分子量约为42kD,Westen-blot显示融合蛋白能被兔抗弓形虫血清识别.结论GST融合表达载体的构建和SAG2基因片段成功表达,为进一步为SAG2重组疫苗及重组诊断抗原的研制奠定了基础.
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泛素--核糖体蛋白S27a基因的克隆、测序及其原核GST融合表达和纯化
目的:克隆泛素-核糖体蛋白S27a基因并在大肠杆菌细胞内高效表达,并纯化该蛋白.方法:从HL-60细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得泛素/核糖体蛋白S27a的编码区cDNA,将Hind Ⅲ/NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样双酶切的GST融合表达载体pGEXGST构建为融合表达质粒pGEXGST-S27a,转化感受态的大肠杆菌JM109实现质粒的扩增与纯化,经DNA测序确证后再转化感受态表达菌BL21,表达并纯化出融合蛋白.结果: (1) PCR 扩增获得长约560bp 的泛素-核糖体蛋白S27a 基因片段.(2) SDS - PAGE 证明, 泛素-核糖体蛋白S27a-GST融合蛋白的分子量为43kDa.(3)通过过柱法纯化出泛素-核糖体蛋白S27a-GST融合蛋白.结论:成功克隆出泛素-核糖体蛋白S27a的基因,并在表达菌BL21中可见GST融合表达,并纯化出该融合蛋白,为进一步研究其功能获得了候选蛋白分子.
关键词： 泛素--核糖体蛋白S27a 基因的克隆 基因测序 GST融合表达 蛋白纯化 -
中国强毒赖型钩端螺旋体新基因OmpL17的表达及其免疫原性
将OmpL17基因克隆于pGEX-1λT载体,在大肠杆菌JM109中表达分子量约为54 KDa的GST-OmpL17 融合蛋白,凝血酶切割后得到了大小约28 KDa的 OmpL17蛋白.用纯化的OmpL17蛋白免疫大白兔,制备了高滴度的特异性抗体(1:4896).本研究获得了纯化的OmpL17及其特异性抗体,为该外膜蛋白致病作用及免疫保护力研究奠定基础.
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GST与戊型肝炎病毒ORF2编码蛋白融合表达形成的新抗原表位的鉴定
目的:以戊型肝炎病毒(HEV)ORF2编码的重组蛋白p166为例,研究蛋白标签GST对融合表达的重组蛋白抗原结构的影响.方法:以HEV中国株重组蛋白p166Chn-GST为免疫原,制备单克隆抗体(mAb),与代表HEV 4个基因型的摩洛哥株、墨西哥株、美国株和中国株p166的GST或His融合蛋白、中国株非融合重组蛋白p179Chn以及GST融合的HEV无关蛋白进行ELISA检测,鉴定mAb所识别的抗原表位. 结果:获得3株稳定分泌抗p166Chn-GST的杂交瘤细胞株,分泌的mAb 1A8、9B4和8H10与p166Chn-GST反应,与GST不反应.其中1A8和9B4可与带GST标签的4种p166-GST蛋白以及N和C端截短的p146Chn-GST、p137Chn-GST反应,而不与4种p166-His蛋白反应,也不与p179Chn反应,与HEV病毒颗粒竞争试验阴性,与GST融合的HEV无关蛋白无交叉反应性,表明1A8和9B4识别的抗原表位不是HEV病毒颗粒表面天然存在的抗原表位,而是GST与HEV ORF2编码蛋白的465-601aa区段序列共同形成的新的抗原表位.结论:GST能够赋予基因工程重组蛋白以新的抗原特性,它与融合表达的重组蛋白可以共同形成新的抗原表位.
