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TPT1真核表达载体的构建及在肝癌细胞系SMMC-7721中的表达
目的:构建TPT1真核表达载体,并转染肝癌细胞系SMMC-7721,为进一步研究奠定基础.方法:通过PCR的方法在TPT1 ORF(open reading frame,开放读码框)两侧添加 Eco RI和 Bam HI的识别序列,将其定向插入真核报告表达载体pEGFP-N3中,构成pEGFP-N3TPT1重构体,卡那霉素筛选阳性克隆,碱裂解法抽提质粒,Sanger法测序,VecScreen和BLAST分析测序结果,lipofectAMINE转染肝癌细胞系SMMC-7721,荧光显微镜及RT-PCR方法检测表达效率.结果:成功扩增了带有特异性核酸内切酶识别位点的TPT1 ORF片段,双酶切后连入pEGFP-N3,测序结果证明TPT1正确插入pEGFP-N3中,转导SMMC-7721后,在荧光显微镜下,可见细胞发出明亮的绿色荧光,转染效率在 30% 左右.RT-PCR分析显示,pEGFP-N3TPT1转导的细胞,TPT1mRNA水平较对照高0.78倍( P <0.05).结论:成功构建了TPT1的真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1,pEGFP-N3TPT1可在SMMC-7721细胞内高效表达.
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TPT1表达载体的构建及在肝细胞系L-02中的表达
目的 构建肝细胞癌高表达基因TPT1真核表达载体,并转导肝细胞系L-02,为进一步研究其在肝细胞癌发生、发展过程中的作用奠定基础.方法 通过PCR方法在TPT1 ORF两侧添加EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列而将其定向插入真核报告表达载体pEGFP-N3中,构成pEGFP-N3TPT1重构体,卡那霉素筛选阳性克隆,碱裂解法抽提质粒,Sanger法测序,VecScreen和BLAST分析测序结果,lipofectAMINE转导肝细胞系L-02,荧光显微镜及RT-PCR方法检测表达情况.结果 将TPT1成功插入pEGFP-N3中,转导L-02后,在荧光显微镜下,可见明亮的绿色荧光.pEGFP-N3TPT1转导的细胞,TPT1 mRNA水平较对照高1.59倍(P<0.05).结论 成功构建了TPT1的真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1,pEGFP-N3TPT1可在L-02细胞内高效表达.
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翻译控制肿瘤蛋白TPT1的原核表达、纯化、抗体制备和初步应用
目的:原核表达并纯化翻译控制蛋白TPT1,免疫日本大耳白兔制备其抗体.方法:构建原核表达质粒pRSETA_2-TPT1,转化大肠杆菌BL21(DE3),TPT1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.融合蛋白通过Ni-NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清.以间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性.结果:在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的TPT1融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫大白兔,获得了高特异性的抗TPT1抗血清.结论:成功构建原核表达质粒pRSETA_2-TPT1,表达并纯化TPT1蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体.为进一步研究TPT1在肿瘤等疾病发生、发展过程及治疗中的作用奠定基础.
