首页 > 文献资料
-
小鼠视锥细胞系661W细胞凋亡模型的构建及自噬对其的保护性作用
目的 构建小鼠视锥细胞系661W细胞凋亡模型,探讨不同自噬水平下细胞生存状态的变化.方法 采用不同质量浓度抗Fas抗体处理细胞,采用Western blot法检测caspase-3蛋白表达量,并确定凋亡细胞模型适宜抗Fas抗体刺激浓度;分别采用不同浓度自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和自噬诱导剂雷帕霉素处理细胞,采用Western blot法检测细胞中微管相关蛋白质1轻链3(LC-3)Ⅱ/LC-3 Ⅰ蛋白表达,筛选合适的作用浓度.将细胞分为空白对照组、单纯3-MA组、单纯雷帕霉素组、模型对照组、模型+3-MA组、模型+雷帕霉素组,采用Western blot法检测各组细胞诱导后0、3、6、12、24和48 h caspase-3、caspase-8、自噬相关基因5(Atg-5)和LC-3Ⅱ/LC-3 Ⅰ蛋白表达,采用流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 成功构建661W细胞凋亡模型,抗Fas抗体的适宜刺激质量浓度为2.0μg/ml;在Fas抗体刺激下,661W细胞caspase-3、caspase-8相对表达量从6h开始增加,12h达高峰,并持续至48 h,而Atg-5和LC-3Ⅱ/LC-3 Ⅰ蛋白相对表达量从3h开始增加,24 h达高峰,并于48 h时降至基线水平.3-MA和雷帕霉素的适宜作用浓度分别为20 nmol/L和2.0 nmol/L.空白对照组、单纯3-MA组和单纯雷帕霉素组诱导后各时间点caspase-3、caspase-8的相对表达量及细胞凋亡率总体比较,差异均无统计学意义(均P＜0.05).单纯雷帕霉素组各时间点细胞Atg-5和LC-3Ⅱ/LC-3 Ⅰ蛋白相对表达量显著高于相应时间点空白对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).模型+3-MA组caspase-3、caspase-8相对表达量以及细胞凋亡率在诱导后3、6、12、24和48 h均显著高于模型对照组,Atg-5和LC-3Ⅱ/LC-3 Ⅰ的相对表达量在诱导后3、6、12和24 h均明显低于模型对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05);模型+雷帕霉素组caspase-3、caspase-8相对表达量以及细胞凋亡率在诱导后6、12、24和48 h均显著低于模型对照组,Atg-5和LC-3Ⅱ/LC-3 Ⅰ的相对表达量在诱导后3、6、12和24 h均明显高于模型对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 在抗Fas抗体诱导661W细胞凋亡条件下,增强自噬可降低细胞凋亡率,而抑制自噬则会增加细胞凋亡率,自噬可能对661W细胞起到保护性作用.
-
血小板源性生长因子-C蛋白在视网膜光感受器细胞损伤模型中的神经保护作用
[目的]探讨血小板源性生长因子-C(PDGF-C)蛋白治疗对视网膜光感受器细胞损伤模型中的神经保护作用.[方法]①检测体外条件下PDGF-C的作用,使用光感受器细胞系661W细胞及原代培养的Pde6brd1视网膜细胞.在体外培养的661W细胞培养液中加入PDGF-C蛋白或者牛血清蛋白(BSA),分别予以同等强度相同时间长短的紫外线照射,然后做MTT检测其细胞凋亡状况,检测PDGF-C蛋白对661W细胞的保护作用.取Pde6brd1小鼠视网膜做原代细胞培养后,在培养液中分别加入PDGF-C蛋白或BSA,相同条件培养后通过免疫荧光染色检测光感受器细胞的生存情况,以检测PDGF-C蛋白对该原代细胞的保护作用.②检测在体条件下PDGF-C的作用,在Pde6brd1小鼠的视网膜下分别注射PDGF-C蛋白及BSA,然后通过组织切片后苏木精-伊红(HE)染色观察视网膜光感受器细胞数量的变化来检测PDGF-C的神经保护作用.[结果]在紫外线诱导的视网膜光感受器细胞661W损伤模型中,培养液中加入PDGF-C蛋白的实验组中,MTT实验显示490nm吸光度(0.2857±0.054)较对照组(0.1726±0.005)增高,P＜0.05.在Pde6brd1原代培养的视网膜细胞中,PDGF-C蛋白组中光感受器细胞的存活率明显高于对照组,P＜ 0.05.在Pde6brd1小鼠的视网膜下注射PDGF-C蛋白,实验组外核层中的每100 μm细胞计数(38.4769±6.1)较对照组(27.2435±5.3)增加,P＜ 0.05.[结论]PDGF-C蛋白在光感受器细胞损伤模型中具有较强的神经保护作用.
关键词： 血小板源性生长因子-C RD1 光感受器细胞 661W细胞
