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姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞中核因子-κB相关炎性因子表达的抑制作用
背景 白细胞介素-1β(IL-1β)是增生性玻璃体视网膜病变(PVR)早期释放的重要炎性因子,研究证实姜黄素能抑制IL-1β诱导的兔视网膜色素上皮(RPE)细胞的增生,但其是否能够对PVR发挥抗炎作用尚不清楚. 目的 观察姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞移行的影响,探讨姜黄素对IL-1β诱导的RPE细胞中炎性因子表达的影响.方法 采用对数生长期原代培养的第4代兔RPE细胞进行实验,在无血清DMEM培养基中分别添加0、0.1、1.0和10.0 μg/L的IL-1β作用于细胞24 h,分别采用Western blot和逆转录PCR法检测细胞中环氧合酶-2(COX-2)蛋白和mRNA的表达以筛选IL-1β佳质量浓度.将培养的RPE细胞分为IL-1β组和姜黄素+IL-1β组,分别在无血清培养基中添加1.0 μg/L IL-1β和1.0μg/L IL-1β联合10 μg/ml姜黄素作用于细胞24、48和72 h,仅用无血清培养基培养的细胞作为对照组.培养的细胞行苏木精-伊红染色,于光学显微镜下计算进入损伤区的细胞数,比较各组细胞的移行能力;分别采用Western blot法和逆转录PCR法检测各组RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量,采用Western blot法检测并比较各组细胞中核因子-κBp65(NF-κBp65)蛋白和核因子κB抑制蛋白-α(IκB-α)的相对表达量;采用免疫化学染色法检测NF-κBp65、IκB-α和COX-2在各组RPE细胞中的表达和定位. 结果 初分离的兔RPE细胞呈球形,细胞中可见大量黑色素颗粒;第4代细胞色素颗粒明显减少,接近融合的细胞形态为长梭形,呈拉网状分布.免疫细胞化学染色法结果显示,细胞角蛋白(AE1/AE3)在细胞质呈阳性表达.对照组在培养24、48和72 h移行的细胞数分别为(31.93±1.21)、(36.27±2.50)和(38.33±2.40)个,IL-1β组分别为(45.73±2.30)、(71.13±1.92)和(80.60±1.71)个,而姜黄素+IL-1β组分别为(13.13±2.20)、(14.93±1.10)和(12.60±1.51)个,各时间点IL-1β组细胞移行细胞数均明显高于对照组,而姜黄素+IL-1β组移行细胞数均明显低于对照组和IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β质量浓度为1.0 μg/L时,RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量达峰,以1.0 μg/L IL-1β的剂量进行后续实验.细胞培养后24、48和72 h,姜黄素+IL-1β组细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量均明显低于IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β作用于细胞后48 h,细胞中NF-κBp65蛋白的相对表达量高,与IL-1β组相比,各时间点姜黄素+IL-1β组细胞中NF-κBp65蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β组药物作用于细胞后48 h细胞中IκB-α降至低,各时间点姜黄素+IL-1β组细胞中IκB-α值均明显高于IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).免疫细胞染色结果显示,IL-1β组RPE细胞的细胞核及细胞质中NF-κBp65呈强阳性表达,对照组表达较弱,姜黄素+ IL-1β组细胞中NF-κBp65的表达强度较IL-1β组明显降低;与对照组相比,IL-1β组细胞的细胞质中IκB-α表达强度明显减弱,而COX-2表达明显增强;与IL-1β组比较,姜黄素+IL-1β组细胞中IκB-α表达明显增强,而COX-2表达明显减弱.结论 姜黄素可抑制IL-1β引起的兔RPE细胞的移行,IL-1β通过激活NF-κB信号通路刺激细胞中COX-2的表达,姜黄素可通过阻断这一途径而抑制炎性因子的表达,从而发挥抗炎作用.
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逆转录病毒感染法对RP患者人体细胞向iPS细胞和iPS-RPE细胞诱导分化的研究
背景 视网膜色素上皮(RPE)细胞移植是目前人类尝试治疗视网膜色素变性(RP)的主要手段.诱导多能干细胞(iPSCs)将成为移植细胞的一个重要来源,人胚胎干细胞(hESCs)可以无限期地自我更新和分化,是RPE细胞移植的重要供体来源.此外,iPS-RPE细胞为患者自身细胞成为治疗源组织提供了个性化治疗平台. 目的 评估利用逆转录病毒将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf44种基因导入RP患者皮肤成纤维细胞后诱导人iPSCs的可行性,并建立将正常人iPSCs诱导分化为RPE细胞的方法. 方法 分别采集基因突变点为SNRNP200 p.S1087L的RP患者及无SNRNP200 p.S1087L突变受试者的大腿皮肤组织块约2 cm×3 cm.采用胰蛋白酶消化和组织块培养法分离纯化得到成纤维细胞并进行传代,取第3代细胞用于研究,分别采用形态学和免疫荧光技术对培养细胞进行鉴定.采用含OCT4、SOX2、C-MYC和KLF4 4种cDNA的质粒病毒转染的成纤维细胞,并用hESCs条件培养液诱导iPSCs,采用细胞形态学、碱性磷酸酶(AP)染色、干细胞表面多潜能标志物表达对所得到的iPSCs和iPS-RPE细胞进行鉴定,并通过细胞在SCID小鼠的体内种植考察iPSCs的成瘤性.采用诱导分化拟胚体(EB)法将不含SNRNP200 p.S1087L突变的iPSCs诱导分化为RPE细胞,分别采用免疫荧光技术和实时荧光定量PCR法检测细胞中特异性蛋白的表达.结果 用皮肤组织块培养的成纤维细胞呈梭形和多角形,光学显微镜下可见细胞间排列紧密,细胞形态和大小趋于一致,细胞中特异性蛋白Vimentin表达阳性.经逆病毒转染的成纤维细胞培养后第5～7天可见小的细胞聚集,细胞形态由梭形变为圆形;培养后20d出现类似hESCs集落形态的iPSCs克隆;培养后25 ～ 30 d细胞中的标志物SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81及Nanog均呈阳性表达,培养后12周形成的iPSCs克隆中AP染色阳性,接种到SCID小鼠体内后形成畸胎瘤.免疫荧光染色显示,诱导分化后30 d时iPS-RPE细胞中RPE细胞特异性标志物RPE65、闭锁小带蛋白1(ZO-1)和卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)蛋白均呈阳性表达.结论 利用逆转录病毒将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf44种基因转入SNRNP200 p.S1087L突变的RP患者皮肤成纤维细胞后可以获得iPSCs,建立的iPSCs有ESCs的形态和多能分化的特征.采用同样的转染技术可在无SNRNP200 p.S1087L突变的人皮肤成纤维细胞中建立体外高分化、高效能的iPS-RPE细胞.
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细胞周期蛋白激酶抑制因子p21和p27在兔视网膜中的表达与细胞增生的关系
背景 细胞周期调节不平衡可诱发增生性玻璃体视网膜病变(PVR),研究周期蛋白依赖性激酶(CDK)及其抑制因子(CKI)对PVR形成过程中视网膜色素上皮(RPE)细胞和成纤维细胞病理增生过程中细胞周期的调控对PVR的防治具有重要意义. 目的 研究CKI p21和p27在不同发育阶段正常兔视网膜中的表达规律,探讨p21和p27表达与细胞生长的关系. 方法 按照兔龄将9只新西兰白兔分为10周龄组、20周龄组和30周龄组,每组3只.实验兔处死后取出双眼分别用于p21和p27在转录水平和翻译水平表达的检测.分离视网膜组织,采用real-time PCR和Western blot法分别检测不同周龄兔视网膜中p21和p27mRNA及其蛋白的表达变化.结果 10周龄组、20周龄组和30周龄组兔视网膜组织中p21 mRNA的相对表达量分别为1.631 ±0.063、1.506±0.012和1.585±0.015,p27 mRNA的相对表达量分别为1.581±0.048、1.470±0.012和1.490±0.013,总体比较差异均有统计学意义(p21:F=9.311,P=0.014;p27:F=12.360,P=0.007),其中10周龄组和30周龄组兔视网膜组织中p21和p27 mRNA的表达量均明显高于20周龄组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).10周龄组、20周龄组和30周龄组兔视网膜组织中p21蛋白的相对表达量分别为0.675±0.061、0.089±0.001和0.200±0.007,p27蛋白的相对表达量分别为0.928±0.019、0.183±0.005和0.576±0.089,总体比较差异均有统计学意义(p21:F=228.905,P＜0.001;p27:F=148.957,P＜0.001),其中10周龄组和30周龄组兔视网膜组织中p21和p27蛋白的表达量均明显高于20周龄组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).兔视网膜中p21与p27间mRNA及蛋白的相对表达量均呈正相关(mRNA:r=0.906,P＜0.01;蛋白:r=0.913,P＜0.01).结论 p21和p27在生长发育期的兔视网膜中表达量升高,随着生长过程变缓其表达量降低,之后随着视网膜组织老年性变化发生病理性表达增加,在细胞周期调控过程中可能起着平衡作用.
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视网膜下腔注射视网膜色素上皮细胞对小鼠视网膜色素上皮层的影响
目的 观察视网膜下腔注射视网膜色素上皮(RPE)细胞对小鼠RPE层的影响.方法 采用随机数字表法将30只7日龄C57BL/6J新生小鼠分成正常组、氧诱导视网膜病变(OIR)模型组及OIR模型细胞移植组,每组10只小鼠.OIR模型组及OIR模型细胞移植组建立OIR模型.OIR模型细胞移植组小鼠建模后经外路视网膜下腔移植RPE细胞.注射20 d后,脊髓脱臼法处死各组小鼠并摘除双眼眼球.行视网膜冰冻切片,荧光显微镜下观察小鼠RPE层厚度变化;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠RPE层RPE65、斑萎蛋白(Bestrophin)、紧密连接蛋白(ZO)-1的蛋白相对表达量;采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测小鼠RPE层RPE65、Bestrophin、ZO-1的mRNA相对表达量.结果 荧光显微镜观察发现,OIR模型组小鼠RPE层较正常组明显变薄,OIR模型细胞移植组小鼠RPE层较OIR模型组明显增厚.Western blot检测结果显示,OIR模型组、OIR模型细胞移植组小鼠RPE层RPE65、Bestrophin、ZO-1蛋白相对表达量比较,差异均有统计学意义(F=8.597、18.864、25.691,P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,OIR模型组、OIR模型细胞移植组小鼠RPE层RPE65、Bestrophin、ZO-1 mRNA相对表达量比较,差异均有统计学意义(F=39.458、11.461、34.796,P＜0.05).结论 视网膜下腔注射RPE细胞可促进小鼠RPE层增厚;RPE65、Bestrophin蛋白相对表达量增加,ZO-1蛋白相对表达量降低;RPE65、Bestrophin、ZO-1 mRNA相对表达量增高.
关键词： 视网膜色素上皮/细胞学 细胞 培养的 动物实验
