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纤溶酶Kringle区缺失突变体对兔眼玻璃体视网膜界面的作用
目的 研究纤溶酶Kringle区缺失突变体(Plm△K)对兔眼玻璃体视网膜界面的作用.方法 Plm△K由毕赤酵母表达的纤溶酶原Kringle区缺失突变体(Plg△K)经组织纤溶酶原激活剂(tPA)激活产生,并通过发色底物S_(2403)测定其蛋白水解活性.0.5、1.0、1.5μmol/min Plm△K 100μL分别注入16只新西兰白兔的玻璃体腔内,注射后1d、7d在光镜下和扫描电镜下检查,并行大体检查、眼部B型超声和光学相干断层扫描(OCT)检查,观察玻璃体视网膜界面情况.结果 还原性SDS-PAGE凝胶成像分析证实,Plg△K被激活后产生相对分子质量约26000和5000的2条肽链,且具有纤溶酶活性.4种检测结果 均显示Plm△K诱导玻璃体皮质与视网膜的分离.视网膜内表面皮质残留量与Plm△K的剂量呈负相关(r=-0.9516,P=0.048),完全性分离可产生光滑的视网膜内表面.Plm△K注射眼与对照眼的视网膜外层结构均未发现明显的差异.视网膜内表面皮质残留量与药物作用时间有一定的关系,但差异无统计学意义(r=-0.720,P=0.470).对照组和Plm△K处理组间视网膜外层的形态学无明显不同.Plm△K玻璃体注射后未发现视网膜发生药物相关的不良反应.结论 玻璃体腔单独注射Plm△K可有效诱导玻璃体与视网膜的完全性分离,而对外层视网膜结构无明显影响.
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人纤溶酶原kringle区缺失突变体的毕赤酵母表达、产物纯化及鉴定
目的 研究人纤溶酶原 kringle 区缺失突变体(PLGΔK)的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达、产物纯化及理化性质鉴定.方法 采用7.5 L发酵罐对工程菌 PLGΔK/GS115 进行高密度培养、甲醇诱导表达,培液经离心、超滤、离子交换层析、凝胶滤过、透析后冷冻干燥.等电聚焦电泳、HPLC、质谱分别检测 PLGΔK 等电点、纯度和分子量;纤维蛋白平板、肽底物S-2403 分别测定PLGΔK 激活后的纤维蛋白和酰胺水解活性.结果 7.5 L高密度发酵可获得约为400 mg/L培液的表达量,经三步纯化后制备的PLGΔK纯度大于96%.理化分析显示PLGΔK的等电点为7.5～7.8,分子量:27.787 kD,比活性:23.6 U/mg.结论 初步建立了PLGΔK的酵母高密度发酵及纯化工艺,所制备半成品活性与血浆提取的PLG相近,具备放大生产和应用的潜力.
