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不同启动子引导的人凝血因子Ⅷ基因载体在HC11细胞和小鼠乳腺中表达的研究
目的 应用山羊β-酪蛋白基因启动子(P1A3),构建真核细胞表达人凝血因子Ⅷ(human coagulation factor Ⅷ,hF Ⅷ)全长cDNA载体(pcDNA3.1-P1A3-hFⅧ)和hFⅧB区缺失(human coagulation factor ⅧB-domain-deleted,hFVⅧBD)的cDNA载体(pcDNA3.1-Pl A3-hFⅧBD),研究它们在乳腺细胞中的表达情况,同时与巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子引导的相应的hFⅧ载体进行比较.方法 采用常规DNA分子克隆技术构建人凝血因子Ⅷ(hFⅧ)基因载体,转染小鼠乳腺上皮细胞(HC-11),应用RT-PCR以及real-time PCR技术检测hFⅧ基因转录本；对哺乳期母鼠乳腺注射DNA载体后,采集试验母鼠乳汁,应用ELISA检测乳腺细胞分泌hFⅧ蛋白的瞬时表达水平.结果 应用构建的CMV启动子和P1A3启动子指导的hFⅧ基因载体转染HC-11细胞后,在mRNA水平均有表达；瞬时转染哺乳期母鼠的乳汁检测表明,转染CMV和P1 A3启动子的hFⅧ载体的母鼠,乳汁中的hFⅧ蛋白表达量分别为2.81 μg/ml (CMV-hFⅧBD),2.01 μg/ml (CMV-hFⅧ),1.82 μg/ml(P1 A3-hFⅧBD),1.20 μg/ml (P1A3-hFⅧ).结论 构建的乳腺特异性表达hFⅧ基因的载体,转染HC-11细胞和乳腺组织后的mRNA及蛋白表达水平均证实了该载体的有效性;CMV启动子引导的hFⅧ载体表达虽稍高于P1A3启动子载体,但由于后者具有乳腺特异表达的特点,更适用于乳腺生物反应器.我们构建hFⅧ基因的载体的经验,为乳腺生物反应器的研制提供了有价值的科学依据.
